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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

PROGRAMA EDUCATIVO QUÌMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

UNIDAD DE APRENDIZAJE BIOTECNOLOGÍA FARMACÉUTICA

MANUAL DE LABORATORIO

ELABORARON: D. en C. Enrique Morales Avila D. en C. Jonnathan G. Santillán Benítez Dra. en C. Ma. Dolores Hernández

Julio 2013

Contenido Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje..............................3 Evaluación del curso.................................................................................................................4 Reglamento de laboratorio........................................................................................................5 Manejo de residuos peligrosos.................................................................................................7 Propósito general......................................................................................................................8 Práctica No. 1 Obtención de ácido cítrico con hongos........................................9 Práctica No. 2 Glucolisis anaeróbica y Fermentación.........................................13 Práctica No. 3 Obtención de emulsina de almendras........................................17 Práctica No. 4 Curva de crecimiento microbiano y obtención de proteasas ................................................................................................................................................22 Práctica No. 5 Fermentación alcohólica...................................................................26 Práctica No. 6 Polímeros y biopolimeros.................................................................30 Practica No. 7 Preparación de soluciones madre para los medios de cultivo...................................................................................................................................33 Practica No. 8 Preparación de los Agares para cultivar in vitro....................37 Práctica No. 9 Cultivo in vitro de plantas (semillas)...........................................40 Practica No. 10 Cultivo in vitro de plantas (órganos vegetales)....................42 Práctica No. 11 Obtención del colorante natural Betalaina a partir de cultivos vegetales de Beta vulgaris (betabel)............................................................................................................44 Práctica No. 12 Bioinformática y biotecnología..................................................50 Prácti

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Introducción A través de los siglos, el empleo de microorganismos en procesos fermentativos ha trascendido hasta nuestros días en la industria alimentaria, química y farmacéutica. Gracias al descubrimiento de la gran variedad de aplicaciones potenciales de las bacterias, levaduras y hongos, surgió la microbiología industrial y el desarrollo de esta especialidad, así como la necesidad del hombre por optimizar procedimientos tecnológicos, para la elaboración de productos de panificación, cerveceros, vinícolas, lácteos, proteicos, antibióticos y aminoácidos, entre otros, se creó una nueva área denominada “biotecnología”. La biotecnología es una disciplina científica derivada de la biología y la tecnología que utiliza la materia viva para degradar, sintetizar y producir los materiales (bioconversiones-biosíntesis) en consideración a la actividad agroeconómica o a la industria en forma fácil y con buen rendimiento económico. Esta rama aprovecha las enzimas libres o fijas, los microorganismos y a las estructuras sub-celulares activas como biocatalizadores. La biotecnología farmacéutica es la rama de la biotecnología encargada del desarrollo de productos biológicos, estos se originan a partir de organismos vivos y células cultivadas para su transformación en proteínas, hormonas, anticuerpos e incluso genes, sirviendo en último término para desarrollar nuevos tratamientos. Si bien hoy en día los productos farmacéuticos representan entre el 5 % y el 7 % del mercado, se estima que en el 2010 las ventas de este tipo de producto superaron el 30 % del total. Una de las principales ventajas de los fármacos producidos desde organismos vivos frente a los tradicionales, es que provocan menos efectos secundarios, sin embargo su principal inconveniente radica en la mayor dificultad de elaboración, que eleva sustancialmente los costos de fabricación. Por otro lado, resulta más atractiva la idea de utilizar biotecnología aplicada a plantas para la producción de bienes de alto valor agregado tales como fármacos, pigmentos y saborizantes, nuevos materiales de soporte para aplicaciones especificas, productos alimentarios innovadores y servicios de alto valor, tales como procesos de selección de nuevos fármacos, procesos de diseño y escalamiento de bioprocesos (ingeniería de procesos), servicios de diagnostico molecular de enfermedades, que por sus métodos químicos de síntesis y procesos tradicionales.

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Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje Práctic a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Nombre de práctica

Sesione s Obtención de ácido cítrico por 2 hongos. Glicolisis anaerobia y 1 fermentación. Obtención de emulsina de 1 almendras. Curva de crecimiento y obtención 1 de proteasas. Fermentación alcohólica. 2 Polímeros y biopolimeros 1 Preparación de soluciones madre 1 para medios de cultivo Preparación de agares para cultivos 1 in vitro Cultivo in vitro de plantas 1 (semillas) Cultivo in vitro de plantas (órganos vegetales) Obtención del colorante natural 3 Betalaina a partir de cultivos vegetales de Beta vulgaris (betabel). Bioinformática y biotecnología 1

Tema

Extracción de ADN, PCR y 1 técnicas delectroforéticas (Laboratorio virtual WEB). Transformación bacteriana 1 (Laboratorio virtual WEB). Obtención de penicilina y 2 comprobación de su acción antibiótica.

5.1.

1.5.1.

Microorganismos industriales

2.1.

Metabolismo energético

3.1.1.

Fuentes de enzimas

3.1.1.

Fuentes de enzimas

3.2. 3.5. 4.2.

Fermentadores Inmobilización celular Producción de metabolitos secundarios Producción de metabolitos secundarios Producción de metabolitos secundarios Producción de metabolitos secundarios Técnicas de cultivo de tejidos

4.2. 4.2. 4.2. 4.2.

5.1.

5.1.9. 6.0 6.2.

Técnicas genética Técnicas genética

de

ingeniería

de

ingeniería

Sistemas de huésped para DNA recombinante Obtención de productos farmacéuticos a través de la biotecnología. Antibióticos.

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Evaluación del curso Evaluación de laboratorio Reportes Aspecto Presentación general Resultados Discusión Conclusiones (incluye cuestionario) Referencias Total

Valor 5 20 60 10 5 100

Desempeño en laboratorio Aspecto Conocimiento de la metodología Desarrollo de la práctica Total

Valor 30 70 100

Calificación final de Laboratorio Reportes Desempeño en laboratorio Examen Proyecto final *especificaciones Total

Valor 50 30 10 10 100

Formato de los reportes Identificación Objetivos Resultados: no fotos, incluir gráficos y observaciones generales observadas. Discusión: realizar una discusión basada en argumentos científicos sólidos (artículos científicos, libros, patentes, reportes técnicos, etc.) Conclusiones: conclusiones puntuales del experimento extrapoladas con los conocimientos adquiridos en la discusión. Cuestionario Referencias

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Reglamento de laboratorio El alumno conocerá y aprenderá el reglamento interno y reconocerá que su acatamiento hará más seguro su trabajo en todo el laboratorio. Debido a los riesgos que implica la manipulación de sustancia perjudiciales al organismo humano, el químico debe siempre comportarse respetuoso de los peligros inherentes de su actividad y ejercer las mayores precauciones. Es igualmente importante que conozca el daño que estas sustancias, mal tratadas o mal desechadas pueden ocasionar a la salud humana y al ecosistema. Por lo anterior, consideramos que es indispensable que todo profesional de la química conozca adecuadamente el reglamento básico al que debe ajustarse su comportamiento. El respeto de dicho reglamento ayudará a preservar su salud e integridad física, lo sensibilizará sobre el hecho de que su labor conlleva un riesgo para sus semejantes y su medio ambiente, y le permitirá desarrollar el sentido crítico necesario para enfrentar aquellas situaciones imprevistas para las que este reglamento no es suficiente. Se sugiere que este reglamento se lea y analice adecuadamente antes de iniciar cualquier actividad en el laboratorio de biotecnología farmacéutica. Reglamento básico A continuación se presenta una serie de reglas básicas que deben seguirse en el laboratorio de biotecnología farmacéutica. Conocer bien las propiedades físicas, químicas y toxicológicas de las sustancia que se van a utilizar. Usar bata de algodón, así como los materiales de protección necesarios (cofia, guantes, gafas). Manipular el equipo caliente con guantes de asbesto o pinzas para evitar quemaduras. Mantener libre de objetos innecesarios la zona de trabajo. Nunca perder de vista los reactivos y el sistema con que se está trabajando. No comer, fumar o jugar dentro del laboratorio. Utilizar todo el material de laboratorio limpio y seco. Nunca pipetear los reactivos con la boca. Nunca regresar al envase original los remanentes de reactivos no utilizados. Lavarse bien las manos al inicio y al final de cada sesión de laboratorio. Antes de usar un reactivo, verificar los datos anotados en la etiqueta y consultar las propiedades físicas, químicas y toxicológicas para el manejo adecuado. Nunca probar el sabor u olor de ningún producto a menos que sea estrictamente necesario y seguro. Para oler una sustancia, esta no deberá colocarse directamente bajo la nariz; por el contrario, se mueve la mano sobre ella para percibir su aroma sin peligro. Los productos químicos nunca se tocan directamente con las manos, especialmente aquellos que, además de su toxicidad pueden producir quemaduras graves. Todo compuesto volátil o que desprenda humos o vapores tóxicos deberá manejarse en las campanas o permanecer en un lugar ventilado. Si se derrama ácido sobre la mesa, se bebe recoger inmediatamente y lavar la superficie con agua varias veces. No debe mirarse dentro de un tubo o matraz que contenga una reacción o sustancia que este calentando. Las soluciones concentradas de bases o ácidos deben neutralizarse antes de ser desechadas al desagüe. No se deben tirar por la tarja líquidos inflamables, irritantes o lacrimógenos.

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Cuando utilice ácidos, hágalo en la campana de extracción y siempre protegiéndose con guantes y lentes de seguridad. Para preparar una solución diluida de ácido se debe añadir, lentamente, con agitación y con enfriamiento externo, el ácido al agua, nunca el agua sobre el ácido ya que la reacción es exotérmica y puede proyectarse violentamente.

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Manejo de residuos peligrosos Los residuos peligrosos son aquellos residuos producidos por el generador con algunas de las siguientes características: infecciosas, combustibles, inflamables, explosivas, reactivas, radioactivas, volátiles, corrosivas y/o tóxicas, que pueden causar daño a la salud humana y/o al medio ambiente. Así mismo se consideran peligrosos los envases, empaques y embalajes que hayan estado en contacto con ellos. Al final de cada práctica se presentará una propuesta de clasificación, registro y recolección de los residuos químicos, para su posterior almacenamiento y confinamiento. Los residuos peligrosos biológico infecciosos (R.P.B.I.) deben clasificarse y recolectarse de acuerdo a la norma NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, que considera como R.P.B.I. los siguientes: Los cultivos y cepas almacenados de agentes infecciosos. Los cultivos generados en los procedimientos diagnósticos y de investigación, asi como los generados en la producción de agentes biológicos. Su activación y tratamiento se lleva a cabo entre otros, por métodos químicos o térmicos, es el caso de la desinfección con hipoclorito de sodio y esterilización por calor seco o calor húmedo frecuentemente utilizados en las áreas de microbiología. Fuente: Guía para el manejo de residuos peligrosos de la UAEM (julio, 2006).

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Propósito general El propósito de este manual de laboratorio es introducir al alumno en las principales tendencias de la biotecnología moderna, como una disciplina capaz de aplicarse a las ciencias farmacéuticas. Poniendo de manifiesto que por medio de esta disciplina, se pueda acelerar el largo proceso que va desde el descubrimiento de un nuevo fármaco hasta su producción comercial. Asimismo explicar y aplicar técnicas de obtención de ácido cítrico, etanol, y colorantes por vía biotecnológica, reconociendo las implicaciones en la reducción de los costos de producción, protección al medio ambiente e incremento de la eficacia del principio activo. En el curso práctico, se permitirá al alumno aplicar sus habilidades para el desarrollo de investigaciones relacionadas con la obtención de fármacos por la vía biotecnológica y será capaz de reconocer como a través de sus técnicas se puede lograr la producción de fármacos con mayor relación riesgo-beneficio.

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FACULTAD DE QUÍMICA, UAEM PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 1 Obtención de ácido cítrico con hongos Introducción El ácido cítrico es un constituyente natural de los frutos. Hasta 1920, la mayor exigencia del mismo era satisfecha primeramente por la extracción a partir de limones, sin embargo eran necesarios de 30 a 40 toneladas de limón para producir 1 tonelada de ácido cítrico. En 1893 Wehmer indico que algunos hongos de la especie Penicilium eran capaces de producir ácido cítrico cuando se desarrollaban en soluciones azucaradas y con sales inorgánicas, desde 1920 se desarrollaron con éxito procesos de fermentación utilizando principalmente cepas de Aspergillus niger, aunque también se han empleado diversos tipos de levaduras. Objetivo general Obtener ácido cítrico por cultivo de esporas de Aspergillus niger en medio de cultivo enriquecido con sales apropiadas para la generación y crecimiento de la biomasa.

Fundamento teórico El ácido cítrico se obtiene por extracción natural de los jugos de frutas cítricas o artificialmente por la transformación del azúcar realizada con algunos microorganismos entre los que se destacan ciertas especies de hongos correspondientes al género Aspergillus. Estos trabajos de producción metabólica con hongos se iniciaron en la década de los años veinte con crecimientos miceliares en superficie, continuaron algunos años más tarde con procesos sumergidos en cubas profundas y actualmente se llevan a cabo tanto en superficie como en fermentadores de hasta 220 metros cúbicos de volumen. Lo realmente valioso de este tipo de producción biotecnológica es que ha alcanzado niveles muy importantes, pues por esta vía microbiológica se obtiene más del 99 % de la producción mundial de este ácido orgánico que comercializado como monohidratado o como anhidro, es utilizado fundamentalmente en las industrias de alimentos y bebidas en las que aumenta o preserva el sabor de los jugos, de los extractos de jugo de fruta, de los caramelos, de los helados y de las mermeladas. En la industria farmacéutica (10% de la utilización total) se utiliza el citrato de hierro y el ácido cítrico como preservante de sangre, o en la elaboración de tabletas, pomadas y en algunas preparaciones cosméticas. En la industria química (25% del uso total) el ácido cítrico se utiliza como reemplazo de polifosfatos, como agente antiespumante, como reblandecedor y para el tratamiento de textiles, mientras que en la industria metalúrgica los metales puros se producen como citratos metálicos.

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Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes. Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos: *NOTA: el material necesario para el cultivo debe estar ESTERIL Aspergillus niger Erlenmeyer de 500 ml con tapón de algodón Pipetas volumétricas Jeringa desechable de 5 ml Embudo Buchner de porcelana con matraz kitazato (solicitar con anticipación al técnico) Asa micológica Papel indicador pH (1-7) Mechero Placa de agitación orbital (solicitar con anticipación al técnico) Gasas Agua estéril inyectable Sacarosa Nitrato de amonio Dihidrogenofosfato potásico Sulfato de magnesio Hidróxido de calcio Ácido sulfúrico diluido Piridina Anhídrido acético Hielo Procedimiento Primera parte

Dejar crecer durante aproximadamente 10 días a temperatura ambiente. Sembrar Aspergillus niger en agar sabouraud (el medio se prepara en tubo de ensayo, se esteriliza con calor húmedo 15 psi

Segunda parte

Preparar un medio de cultivo líquido que por su composición permita el crecimiento miceliar. 00 mL (pH: 2) que incluye: 19.0 g de sacarosa, 230 mg de nitrato de amonio, 100 mg de dihidrogenofosfato potásico, y 0.03g de sulfato de magnesio.

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12 Para un ensayo cuantitativo, se debe consultar alguna farmacopea en la que se encuentren técnicas específicas de análi La aparición de un color rojo indica la presencia de citrato.

a 15 mililitros Se adicionan 5 mililitros de anhídrido acético ydesepiridina, mezcla.agregar unos pocos miligramos de un citrato disuelto o suspendido en 1 mililit

Identificación cualitativa de citratos: el sobrenadante, una vez lavado en frío (agua de hielo) se precipitan algunos cristales de ácido cítrico.

Se obtiene un precipitado de sulfato de calcio insoluble por lo que se filtra la solución.

11. En

Una vezcon neutralizado, calienta y se excesodiluido. del hidróxido, con el que probablemente se obtiene un precipitado insoluble El filtrado es tratando cantidades se equivalentes deañade ácido un sulfúrico

Se filtra la solución. placa de agitación (150 rpm) porDespués espacio de de 77 aa 14 14 días días:en los que se controla periódicamente el pH para facilitar la obtención del metabolito. El medio de cultivo (microorganismo incluido), se macera y filtra, resultando un licuado cuyo pH se debe neutralizar

Una vez esporulado el hongo (en el medio agar sabouraud), se le agregan 5 mL de agua estéril, se agita suavemente para desprend ren al erlenmeyer donde se encuentra el medio de cultivo preparado con azucares 7 sales inorgánicas.

tivamente lenta puesto que la superficie de la capa de hongos será pequeña en comparación con el volumen, inversamente con el empleo de recipientes

Cuestionario ¿Cuál son los análisis cuantitativos recomendados por la farmacopea en el proceso de obtención de citrato? ¿Cuál es la vía metabólica que utiliza el Aspergilus niger para la producción de citrato? ¿Es posible inhibir la síntesis de citrato por él microorganismo? ¿Por qué es importante el control del pH para la obtención del producto? ¿Por qué es útil el citrato en la industria farmacéutica? ¿Cuál son las razones para el uso de Aspergillus niger en relación a otros microorganismos?

Observaciones

Bibliografía CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiología Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. 3ª edición. 1989. JAGNOW, Gerhard. Biotecnología “Introducción con experimentos modelo”. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. 1991. PRESCOTT, S.C. Microbiología Industrial. Aguilar S.A. Ediciones Madrid.

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 2 Glucolisis anaeróbica y Fermentación Introducción La respiración celular es el conjunto de reacciones químicas mediante las cuales se obtiene energía a partir de la degradación de sustancias orgánicas, como los azucares y los ácidos, principalmente. Comprende una primera fase donde se oxida la glucosa y requiere del oxigeno, por lo que recibe el nombre de glucolisis anaerobica, la reacción que se lleva a cabo en el citoplasma de la célula. La fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleto, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones. En el proceso de fermentación anaeróbica intervienen dos sustancias orgánicas, que son metabolitos de un mismo sustrato que durante el proceso de fermentación se escinde en dos sustancias orgánicas diferentes: Sustancia reductora: Es la que dona los hidrogeniones y por lo tanto se oxida. Sustancia oxidante: Es la que acepta los hidrogeniones y por lo tanto se reduce. En los seres vivos, la fermentación es un proceso anaeróbico y en él no interviene la cadena respiratoria. Son propias de los microorganismos, como las bacterias y levaduras. También se produce la fermentación en el tejido muscular de los animales, cuando el aporte de oxígeno a las células musculares no es suficiente para el metabolismo y la contracción muscular. Objetivo Observar los efectos en una situación simulada de la fermentación anaerobia que en la realidad se efectúa en los seres vivos y verificar la inhibición ocasionada en la ruta metabólica de la glicolisis por el NaF.

Fundamento teórico De todos los organismos vivientes solo unas pocas especies son estrictamente anaerobias, esto es, que solamente pueden vivir en ausencia de oxigeno. La mayoría son microorganismos, en particular aquellas especies propias del ambiente que tiene poco oxigeno o que carece de él, es decir, en los intestinos de los animales, en el suelo profundo, en sedimentos que se encuentran bajo los lagos y océanos o en pantano donde el oxigeno esta casi totalmente ausente. Un ejemplo de estas bacterias del suelo Clostridium perfringens, que causa la gangrena gaseosa en infecciones de heridas. El producto de la fermentación varía de un tipo de célula o microorganismo a otro. Cuando se requiere concentración repetida de células musculares, el suministro de oxigeno no tiene capacidad para mantener el paso de las demandas metabólicas de la célula. En estas condiciones ciertos tipos células musculares esqueléticas regeneran NAD convirtiendo piruvato a lactato (fermentación del acido láctico). Las células de levaduras han enfrentado el desafío de la vida anaerobia con una solución metabólica diferente, convierten el piruvato a etanol (fermentación alcohólica, ver figura 1).

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Figura 1. Esquema metabólico de la fermentación. Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes. Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos Tubos de ensayo de 13 x 100 con tapón de plástico (preguntar al profesor) Vasos de precipitado de 300 ml Baño maria 1 hoja de papel milimétrico Manguera de plástico transparente de 3-5 mm de diámetro (se consigue en los acuarios, el diámetro debe coincidir con la parte superior de la pipeta pasteur, también se puede usar un equipo de venoclisis) Pipera pasteur Agua destilada Levadura (fresca 5 a 10%) Glucosa (5 a 10%) Fluoruro de sodio (5 a 10%)

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16 vadura y colocar cada pesada en un tubo de ensayo esteril adicionando 3 mL de solución glucosada al 10 %, incubar 72 h a 28 °C, transcurrido el tiemp

Examinar los tubos de la siguiente manera (si es posible durante 6 lecturas). Tubo A: cada tres minutos 11. Hacer el análisis de la gráfica y un análisis de varianza (ANOVA) Tubo B: cada minuto Tubo C: cada 15 minutos y hacer una grafica colocando en la ordenada el tiempo en minutos y en la abscisa la producción de CO2 en mL.

Colocar en baño maría a 37 °C. (Si el procedimiento estuvo bien hecho, solo quedara una columna de aire en la parte su Medir la altura del líquido en la manguera en U al conectar.

ico e introducir 0.5 mL de agua por el lado opuesto de la manguera (tenga cuidado el agua no debe llegar al medio de cultivo). Conectar un segmento de manguera (40 cm) a la parte superior de la pipeta Pasteur.

tubo y taparlo, invertir suavemente para mezclar. No debe Introducir quedar airedeenforma la parte cuidadosa superiorundel segmento tubo. de una pipeta Pasteur en el tapón de plástico.

una tercera parte del tubo con suspensión de levadura*, agregue otra tercera parte con solución de glucosa y termine de llenarlo con solución de fluorur

2.2. Tubo B: Llene una tercera parte del tubo con suspensión de levadura* y agregue solución de glucosa hasta llenarlo totalmente.

2.1. Tubo A: Llene una tercera parte del tubo con suspensión de levadura* y luego agregue agua destilada hasta llenarlo totalmente.

Marcar tres tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera

Procedimiento

Cuestionario 1. El ATP da el impulso inicial para inicial al glucolisis, fosforilando la glucosa. ¿Cuál es la reacción involucrada en el proceso? 2. La fructosa 1-6-difosfato origina dos triosas que pueden interconvertirse. ¿Cuáles son estas? 3. Los dos productos de la glucolisis piruvato y NADH, se pueden metabolizar siguiendo dos vías muy diferentes según el tipo de célula en la cual se generan. ¿Cuáles son estas dos vías? 5. Escriba la reacción de la fermentación del ácido láctico. Y diga dos ejemplos de células que la realizan. 6. Escriba la reacción de la fermentación alcohólica y diga dos ejemplos de células que la realizan. 7. Escriba la reacción general de la respiración celular u oxidación aerobia. 8. ¿En qué lugar u organélo de las células procariotas y eucariotas se da la fermentación (oxidación anaerobia del NADH) y la respiración celular (oxidación aerobia) y bajo qué condiciones se da cada una? 9. ¿Qué influencia tiene el NaF en el proceso de la fermentación y por medio de que mecanismo lo hace?

Observaciones

Bibliografía CORN Y STUMPF, Bioquímica Fundamental, Editorial Limusa, 1998 DEVORE G. y Muñoz Mena, Química Orgánica, Editorial Publicaciones Culturales, México 1992.

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 3 Obtención de emulsina de almendras Introducción Se obtendrá la enzima emulsina (α-galactosidasa) a partir de almendras amargas, la cual es capaz de degradar los enlaces β-glucosidicos, presentes en polímeros como la celebiosa o maltosa obteniendo azucares simples como D-glucosa o D-galactosa.

Objetivo Obtener una enzima, la emulsina, a partir de almendras dulces. Comparar la actividad de la emulsina obtenida, bajo dos diferentes temperaturas por acción sobre el p-nitro fenil -β -D- glucósido.

Fundamento teórico Las almendras dulces son muy nutritivas: más de la mitad de su peso corresponde a grasas vegetales digeribles, tienen más proteínas que la carne de vaca y son ricas en fósforo, calcio y vitaminas del grupo B. También poseen una enzima, la emulsina o sinaptasa, que favorece la digestión. Desde el punto de vista medicinal, aumentan la secreción de leche materna cuando ésta es escasa y tienen propiedades antihelmínticas, esto es, favorecen la expulsión de lombrices intestinales. La leche de almendra, que se obtiene triturando almendras secas y peladas y luego mezclándolas con agua, se recomienda como sustituto de la leche de vaca y en tratamientos de problemas cardiovasculares y diabetes. Las almendras amargas contienen además amigdalina, un glucósido que por acción de la emulsina y en presencia de agua, produce ácido cianhídrico. Este ácido, antiguamente llamado ácido prúsico, se combina con el potasio para dar cianuro potásico, que es un veneno muy potente. Por suerte, las almendras amargas, como su propio nombre indica, tienen mal sabor y son raros los casos de envenenamiento involuntario por ingestión de esta variedad. UNIONES GLUCOSÍDICAS La unión glicosídica más frecuente es la unión 1,4´. El carbono anomérico de un azúcar se enlaza al átomo deoxígeno de C4 del segundo anillo.

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Celobiosa: enlace glusídico β-1,4´. La celobiosa, disacárido obtenido a partir de la hidrólisis parcial de la celulosa, contiene un enlace 1,4´. El carbono anomérico de una unidad de glucosa se une, a través de un enlace ecuatorial (β) carbono-oxígeno, al C4 de otra unidad de glucosa. A este enlace acetálico β-1,4´ entre dos moléculas de glucosa se lo denomina enlace β-1,4´glucosídico.

Maltosa: enlace glucosídico α-1,4´. La maltosa es un disacárido que se obtiene cuando se trata el almidón con cebada germinada, denominada malta.Este proceso de malteado es el primer paso para la obtención de cerveza, transformando los polisacáridos y monosacáridos que fermentan fácilmente. Igual que la celobiosa, la maltosa contiene un enlace glucosídico 1,4´ entre dos unidades de glucosa. La diferencia en la maltosa es que la estereoquímica del enlace glucosídico es α en lugar de β.

Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes. Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos Erlenmeyer de 125 mL Erlenmeyer de 250 mL Vidrio de reloj Embudo de vidrio (puede ser sustituido por un embudo Buchner con matraz Kitasato, solicitar previamente al técnico laboratorista) Pinzas de tres dedos con nuez Espátula Agitador de vidrio

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20 la extracción con hexano, en las mismas condiciones. ue las almendras en un vaso de precipitados de 400 mL, agregue 100 mL de agua caliente y deje remojar durante 15 minutos, después de este tiempo pe asvase su extracto hexánico procedente de la extracción a temperatura ambiente o a reflujo, a un matraz de 125 ml y adapte un sistema de destilación pa

Nota: . Extienda las almendras desengrasadas sobre un vidrio de reloj y permita que se sequen en la campana, ya secas deberán pesarse y guardar

3. Filtre la mezcla.

4. Lave con 10 mL de hexano.

Coloque 30 g de las almendras peladas y molidas en un matraz Erlenmeyer de 500 mL al que se le adapta un tapón horadado, a ón manual, no caliente y mantenga estas condiciones por 15 minutos, posteriormente suspenda la agitación.

Desengrase de las almendras Procedimiento Almendras 30 g Hielo Hexáno Acetona 50 mL Ácido acético al 1 % p-nitro fenil-D-glucosido Probeta de 25 mL Recipiente de peltre Frasco vial Matraz de bola con refrigerante Matraz kitasato con embudo buchner Placas de agitación magnética con barra magnética

21 ¿Con qué otros nombres se conoce a la emulsina? ¿Por su modo de acción, ¿cómo se clasifica esta enzima? Escriba la reacción que se produce entre la enzima y el glucósido. La comparación de la actividad enzimática de la emulsina extraída de las dos muestras de almendras dulces tratadas, a que conclusiones le lleva. ¿Qué otro glucósido natural podría emplear para comprobar la actividad de la enzima? ¿Qué usos podría darle al residuo de las almendras? Proponga un método para hacer la determinación cuantitativa del p-nitro fenol formado durante la reacción con emulsina. Cuestionario 6. Agite y observe los cambios y el tiempo en que se producen.

quela en un frasco vial, agregue 2 ml de agua destilada, agite y agregue 1 mg del p-nitro fenil-β-D-glucósido. Tome un poco de la emulsina que se encuentra en el papel filtro y colóquela en un vidrio de reloj y deje s

Comprobación de la actividad de la emulsina 5. Mantenga la solución en el baño de hielo durante 10 minutos, posteriormente filtre por gravedad. ina se puede recuperar del papel filtro y coloca en un vidrio de reloj y se seca por evaporación.

4. La solución filtrada se enfría en baño de hielo, y se le añade poco a poco 25 mL de acetona. 3. Se suspende la agitación y se filtra por gravedad (o al vacio).

Pesar 10 g de polvo de almendras desengrasadas y colocarlas en un matraz Erlenmeyer de 125 mL r 40 ml de ácido acético al 1 %, someta la mezcla a una agitación constante durante 20 minutos.

Extracción de la emulsina

Observaciones

Bibliografía Giral .J. y Rojahn, “Productos Químicos y Farmaceuticos”, Méx. (1966). Quintero Angelina. Facultad de Química. Tesis. México D.F. (1963) Methods in enzimology Vol.VIII, pág. 42 Baker, Pardoe, Hapton, “Nature”, 197, 231 (1963) http://bq.unam.mx/wikidep/uploads/MensajeBioquimico/Mensaje_Bioq04v28p061_Polaina_04.pdf

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 4 Curva de crecimiento microbiano y obtención de proteasas Introducción Los microorganismos producen una gran variedad de enzimas, la mayoría de las cuales son generadas en bajas cantidades y están involucradas en procesos metabólicos celulares. Muchas enzimas importantes de producción industrial, como las proteasas, son obtenidas utilizando fermentación. De manera general, este proceso se puede definir como una operación unitaria que consiste en la transformación biológica de materias primas a productos a través de microorganismos.

Objetivo Establecer una curva de crecimiento a partir de un cultivo controlado de Bacillus subtilis. Establecer el grado de relación entre la producción metabólica secundaria de proteasas y las diferentes fases de una curva de crecimiento microbiano.

Fundamento teórico El incremento poblacional que resulta de la multiplicación celular, es un componente esencial de la función microbiana, y con él se asocian, tanto el crecimiento, como la generación metabólica; de hecho, las bacterias son máquinas de duplicación constante en las que se incluyen reacciones cuya finalidad es la formación de las macromoléculas necesarias para el ensamblaje de las nuevas estructuras celulares de sus descendientes. Como en la mayoría de los procariotes, el desarrollo de una célula individual es continuo hasta la división en dos células nuevas (fisión binaria), el conocimiento de las características de crecimiento de un microorganismo es muy importante, pues con ello se pueden reproducir los procesos industriales y aumentar los rendimientos propios de los procesos generadores de metabolitos. En cultivos de producción por lotes (sistema batch), el aumento en la masa celular como consecuencia del cambio en el número de células o absorbancia (Abs) por unidad de tiempo (Velocidad de crecimiento), permite establecer una curva típica de crecimiento (Figura 1) en la que se pueden observar las diferentes fases de la misma: latencia (a), exponencial (b), estacionaria (c) y muerte celular (d), y el grado de asociación de estas con la generación de metabolitos primarios y secundarios, pues los primeros son aquellos que se forman durante el crecimiento exponencial, mientras que los segundos, como las proteasas objeto de la práctica, se producen casi al final de la fase exponencial de crecimiento y son compuestos que no hacen parte del metabolismo energético de la célula.

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Figura 2. Curva de crecimiento bacteriano, 1. Fase lag (latencia), 2. Fase log (exponencial). 3. Fase estacionaria. 4. Fase de muerte celular. El crecimiento microbiano se traduce en un incremento en la masa celular, en donde la Velocidad de crecimiento, es el cambio en el número de células o absorbancia (Abs), experimentado en unidad de tiempo. Durante el crecimiento de los microorganismos, se generan una serie de metabolitos, que pueden clasificarse como primarios y secundarios. Los primarios son aquellos que se forman durante la fase de crecimiento exponencial y además se forman como parte del metabolismo energético de las células, mientras que los metabolitos secundarios se forman casi al final de la fase exponencial de crecimiento y son compuestos que no hacen parte del metabolismo energético de la célula. Como ejemplos de metabolitos se encuentran etanol, proteasas, entre otras. Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes. Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos *NOTA: Material estéril necesario

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Espectrofotómetro agitador orbital centrífuga baño de agua erlenmeyer (250 mL) tubos de ensayo (3) pipetas estériles de 1 y 5 mL

papel milimetrado. Microorganismo Bacillus subtilis Caldo nutritivo Solución de ácido tricloroacético caseína (leche)

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26 Una vezobservaciones. alcanzada la fase exponencial, este volumen completo se utiliza como inóculo del erlenmeyer y se incuba a 28° C con una agitación orbit 10. Anotar e cultivo y cuantificar la absorbancia (550 - 600 nm), utilizando como blanco el medio de cultivo estéril que se almacena en los frascos pequeños. ciona un mililitro de ácido tricloroacético. 9. Se llevan los tres tubos a baño de agua (30ºC) durante 30 minutos.

L de medio de cultivo microbiano libre de células, previamente sometido durante 2 minutos a 100 ºC. Con ayuda de un asa de cultivo, se toma una muestra del microorganismo a utilizar y transferir al tubo de ensayo dispuesto con los ci

Tubo 2 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de células. Esterilizar en autoclave. e ensayo con cinco mililitros, un erlenmeyer cien mililitros y veinticinco mililitros repartidos en frascos pequeños a razón de aproximadamente 3 m Tubo 1 + 1 mL decon agua (blanco). Al inicio de práctica, cada uno de los grupos de trabajo debe alistar ciento treinta (130 mL) de un medio de cultivo nutritivo preparado s determinar la producción se toman muestras con la periodicidad indicada y se centrífugan (4.000 rpm, 10 minutos). mLPara de solución de caseína o lecheproteasas muy diluida siguiendo las instrucciones siguientes:

Parte 1. Curva de crecimiento

Parte 2. Determinación de proteasas

Procedimiento

Cuestionario Menciona al menos tres ejemplos de metabolitos primarios y secundarios de utilidad farmacéutica, obtenidos del metabolismo bacteriano. Esquematiza la reacción de las proteasas sobre la caseína o leche. ¿Cuál son los factores que afectan la obtención de las proteasas? Menciona las ventajas y desventajas de la obtención de metabolitos intracelulares y extracelulares.

Observaciones En esta práctica se utilizará como método para determinar el crecimiento microbiano, la medida de la densidad óptica, para ello se registrarán los resultados obtenidos en la siguiente tabla: Lecturas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo de cultivo

Absorbancia (550 nm)

Reportar los datos obtenidos a partir de la acción del sobrenadante sobre la proteína caseína.

Bibliografía Jagnow, G., David, W. Bitecnología. Introducción con experimentos. 1991. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 251p. Madigan, M., Martinko, J., Prker, J. 2004. Brock. Biología de los Microorganismos. Décima edición. Pearson Education S.A. Madrid. 1011p. Martínez, M., Carrascal, A., Martínez, P. 1999 Manual de Laboratorio. Introducción a la Biotecnología. Facultad de ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. 81p.

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 5 Fermentación alcohólica Introducción La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azúcar en alcohol etílico y dióxido de carbono. La fermentación alcohólica, comienza después de que la glucosa entra en la célula. La glucosa se degrada en un ácido pirúvico. Este ácido pirúvico se convierte luego en CO 2 y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso para hacer pan, cerveza, y vino. En estos tres productos se emplea el microorganismo Saccharomyces cerevisae.

Objetivo El alumno debe utilizar el metabolismo de las levaduras para producir alcohol etílico (etanol), a partir de un jugo enriquecido con azúcares fermentables.

Fundamento teórico La fermentación alcohólica es utilizada desde la antigüedad para realizar productos como la cerveza o el vino. Sin duda, dichos procesos fueron esenciales para el desarrollo de la alquimia en la Edad Media. Los descubrimientos químicos posteriores llevaron al investigador, Gay-Lussac, a describir la reacción de fermentación que tenía lugar partiendo de la glucosa, con obtención de etanol. Fueron muchos científicos los que intentaron dar explicación al proceso que hoy conocemos como fermentación, pero hasta 1818 se descubre que las causantes del proceso eran las levaduras. Pocos años después, se descubre la enzima responsable del proceso, la zimasa, otorgándose el Premio Nobel de Química en 1897, por dicho descubrimiento, a Eduard Buchner. En los años posteriores, se siguió trabajando en el tema, hasta que en 1929, se descubre el co-factor NADH, esencial en el proceso de fermentación, pues su principal función es el intercambio de electrones. Para describir la palabra fermentación se refirió originalmente al metabolismo anaeróbico de los compuestos orgánicos mediante microorganismos o sus enzimas para dar lugar a productos más simples que la materia prima. La definición actual es: “Cualquier acción microbiana controlada por el hombre para obtener productos útiles”. Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y segregan algunos compuestos bioquímicos de importancia para el hombre; estas son las características en las que se ha basado el uso de los microorganismos como productores de fermentación, la que de una manera esquemática se puede representar como: Temperatura + O2 Microorganismos + CO2(g) + Productos intra y extracelurares.

Microorganismos + nutrientes

En el curso de la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico es descarboxilado a acetaldehído y a CO2. La reducción de acetaldehído forma etanol. Se pueden producir otras sustancias en pequeñas

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cantidades en especial el glicerol y el ácido acético. Este proceso se lleva a cabo a atas concentraciones de azucares (20 %) y a valores de pH entre 5.0 y 6.0; además se requiere de un inoculo grande y vigoroso. La cepa debe estar previamente adaptada a ciertos agentes químicos inhibitorios de crecimiento microbiano como lo es el pirosulfito y metabisulfito de sodio, además de ser resistente a grandes concentraciones de etanol y ser temperatura dependiente (alrededor de 20 °C) de acuerdo con el tipo de cepa empleado. Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes. Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos 1 Agitador de vidrio 1 Anillo de Fierro 1 Cuchillo 1 Coladera grande 1 Matraz de destilación 1 Mechero Bunsen 2 Pipetas graduadas de 5 ml 1 Pipeta graduada de 10 ml 1 Pinzas para tubo de ensayo 3 Pinzas universales 1 Pinzas Hoffman 1 Franela 1 Mortero con pistilo 1 Tela de alambre con asbesto 2 Tapones monohoradados 3 Tubos de ensayo de 16x150mm 1 Termómetro 1 Vaso de precipitado de 250 ml 45 cm de Manguera de látex de 4mm de diámetro 1 Refrigerante 2 Soportes universales 1 Frasco claro con tapa, de 3 a 5 litros, de boca ancha. 1 Frasco claro sin tapa de 200 a 300 m 100 g de Glucosa 250g de cascara de piña 200 mL de jugo de piña 250g de piloncillo o azúcar 100 mL de Hidróxido de bario al 2 % 6 mL de reactivo de Fehling A y B 2 L de Agua

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Microorganismo de trabajo Se empleará Saccaromyces cerevisiae, será mantenido en tubos con medio inclinado de Sabouraddextrosa-agar, una vez inoculados los tubos se incubarán a 28 °C durante 43 h. Medios de cultivo y medio de producción La formación del medio de cultivo para la elaboración del inoculo o semilla se realizará con los siguientes componentes: Harina de granos * piloncillo o melazasa tratadas (todas ajustadas a 25° Brix) 15 % de azucares. ** Jugo de frutas (NH4)2SO4 ……………….……….1.0 g/L (MgSO4.7H2O) …………………….1.0 g/L (NH4)2HPO4…….………………….1.0 g/L Extracto de malta ……………….…10.0 g/L pH ……………………………….5.0-6.0 Procedimiento Consideraciones * Cuando un medio de cultivo se prepara a base de piloncillo, disolver este en un mínimo de agua y calentar lentamente hasta la disolución, pasarlo a l garrafón correspondiente y ajustar la concentración de azúcares que se pide adicionando agua o piloncillo disuelto. Nota. Esta práctica se llevara a cabo en 3 sesiones de laboratorio. Primer Sesión

Comprimir la pulpa de la piña hasta obtener un volumen Lavar, pelar aproximado y hacerde trocitos 200 mldede2.5 jugo cm aproximadamente de la cáscara y de la pulpa de la piña (u otra Lavar perfectamente 1 frasco claro de 3.5 L de boca ancha. Adicionar al frasco 200 ml de jugo de fruta, toda la cáscara de la piña en cuadritos, 250 g de piloncillo, 100 g de az Del sobrenadante se extraer con 3 mL y se depositar en un tubo de ensayo. Determinar A la7.tapa del frascoelsepHle hará un orificio para adaptar 45 cm de manguera de látex de 4 mm de diámetro a la cual se le col

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31 Explica la diferencia metabólica entre la fermentación alcohólica y láctica? Menciona al menos dos rutas metabólicas diferentes que involucren la fermentación alcohólica. ¿Por qué son necesarios los azucares reductores? ¿La descarboxilación del piruvato es reversible? Explica detalladamente tu respuesta. ¿Cuál son los productos de la reacción catalizada por piruvato deshidrogenasa? En una célula concreta, ¿Cuál son los factores que determinan el destino catabólico del piruvato? ¿Cuál es la coenzima derivada de la vitamina B1 que participa en la descarboxilación oxidativa del piruvato? ¿Cuál es el fin metabólico del piruvato? Cuestionario ación de pH y azucares reductores (repetir los pasos 7,8 y 9, de la primera sesión: (pH) y Azucares Reductores ( + o -). Montar el equipo de destilación y destilar el alcohol.

Transcurridos los 6 días, se decantar el sobrenadante en un vaso de precipitado. Filtrar el sobrenadante.

Segunda Sesión Anotar observaciones Continuar la fermentación por otros 6 días.

Se abre lentamente la pinza de Hoffman, con el objeto de que el gas producido entre en contacto con la

Transcurridas las 24 h sumergir la manguera de látex del frasco en 100 mL de solución de hidróxido de Bario al 2%, dispuesta en un fr el segundo tubo. Calentar suavemente con el fin de detectar la presencia de azucares reductores.

teriormente agregan 1.5 mL de reactivo de Fehling A y 1.5 mL de reactivo de Fehling B

Observaciones

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Bibliografía CORN Y STUMPF, Bioquímica Fundamental, Editorial Limusa, 1998 DEVORE G. y Muñoz Mena, Química Orgánica, Editorial Publicaciones Culturales, México 1992.

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AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 6 Polímeros y biopolímeros Introducción Los polímeros son tan antiguos como la vida misma ya que toda la vida en la tierra se basa en tres tipos de polímeros: DNA, RNA y proteínas. Las macromoléculas o polímeros son moléculas con una estructura básicamente covalente entre sus átomos pero que poseen un elevado peso molecular. Se consideran polímeros moléculas con masa moleculares superiores a 10 3 - 104, pudiendo llegar a valores del orden de 1010 como el ácido desoxirribonucleico. Este elevado peso molecular, y consecuentemente tamaño, es lo que les confiere unas propiedades peculiares.

Objetivo general. Conocer procedimientos básicos para la obtención de polímeros naturales y sintéticos, útiles en procesos de biotecnología.

Fundamento teórico El polímero es un compuesto químico que posee una elevada masa molecular y que es obtenido a través de un proceso de polimerización. En tanto, la polimerización consiste en la unión de varias moléculas de un compuesto a partir del calor, la luz o un catalizador, con la misión de conformar una cadena de múltiples eslabones de moléculas y así entonces obtener una macromolécula. Existen numerosos grupos de investigación dedicados al estudio de las aplicaciones de los polímeros inteligentes en biotecnología y biomedicina. En este campo, destaca el uso de estos materiales como vehículo para la administración de fármacos. Por ejemplo, las características que presentan determinados polímeros son de especial relevancia en la fabricación de sistemas de suministro de insulina para el tratamiento de pacientes diabéticos. Otra aplicación interesante es el uso de sistemas poliméricos biodegradables como soporte o andamiaje en la regeneración de tejidos o bien como implante para la fijación de fracturas óseas. La industria farmacéutica cuenta actualmente con diversos fabricantes de polímeros comerciales sensibles a cambios de pH que son empleados como recubrimiento de fármacos.

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En el campo de las tecnologías electrónicas, los polímeros conductores presentan similitud con los fenómenos biológicos, las propiedades y las funciones que realizan los músculos naturales. Gracias al comportamiento electro-mecánico de estos polímeros inteligentes se han desarrollado músculos artificiales con sensibilidad al tacto, que son capaces de empujar un obstáculo de acuerdo al esfuerzo necesario. Aspectos de seguridad e higiene Los necesarios del laboratorio de biotecnología farmacéutica.

Materiales, reactivos y procedimiento: Biopolímero de almidón Los biopolimeros son plásticos derivados del almidón de maíz. Se trata de un material que supone diversas aplicaciones. Sus principales características es que puede degradarse en el medio ambiente como la materia orgánica. 2.5 g de almidón o fécula de papa. 2.0 ml de glicerina 3 ml de HCl (dil) 3 mL de NaOH (dil) Mezclar en un vaso de precipitado todos los ingredientes a excepción del NaOH y agregar 20 mL de agua. Colocar en un baño maria durante 15 min en agitación constante. La solución se pondrá viscosa. Neutralizar la mezcla agregando los 3 mL de la solución de NaOH y mezclar. Verter el contenido sobre una placa de vidrio, extendiéndolo lo más homogéneamente posible. Colocar en una estufa (no mayor de 100 °C) hasta secar. Formación de polímeros de Alginato Se realiza por precipitación de la solución de alginato sódico, gota a gota, sobre una disolución de cloruro cálcico. Concentraciones de alginato sódico: 2,5 y 3,5% y concentración de cloruro cálcico: 0,5. Las esferas resultantes se dejan en agitación suave por media hora y posteriormente se lavan con agua destilada. Polimeros de Slime 100 mL de disolución de polialcohol vinílico 4% (PVAL). 250 ml de disolución de borato de sodio 4% en recipiente cuentagotas 1 Colocar 10 ml de PVAL 2 Adicionar 15 gotas de la solución de borato de sodio al PVAL y remueve hasta que no se produzca ningún cambio 3 Saca el polímero del recipiente y déjalo encima de la mesa. Observa las propiedades del producto que has obtenido.

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Formación de polímeros de quitosano Se sintetizan por precipitación de una solución al 2% de quitosano disuelto en ácido acético al 2%, sobre otra disolución de hidróxido sódico. Se utilizarán dos concentraciones de hidróxido sódico: 0,5 y 1,0 M. Las esferas de quitosano formadas se mantienen por 30 min en la solución de NaOH y luego se lavan con abundante agua destilada hasta llegar a la neutralidad. El polímero resultante es soluble en ácidos diluidos y presenta pobres propiedades mecánicas.

Cuestionario ¿Qué es un polímero? ¿Qué es un biopolímero? De acuerdo a su origen, ¿cómo se pueden clasificar a los polímeros? Que es una reacción de policondensación Que son los homopolímeros y los copolimeros Describe dos tipos de reacciones por las que se puede llevar a cabo la polimerización. Describe las aplicaciones biotecnologícas de los polímeros. Realiza una revisión bibliográfica donde se mencione el uso de polímeros en procesos de biotecnología (cita las referencias).

Observaciones Estudio de propiedades mecánicas: - Comparar las propiedades químicas de los diferentes polímeros. (Estíralos suavemente y después fuertemente). - Prueba si un trozo pequeño se aplana cuando lo aprietas.

Bibliografía Billmeyer F.W. 1975. Ciencia de los polímeros. Ed. Reverte MARÍA CINTA VINCENT VELA, SILVIA ÁLVAREZ BLANCO, JOSÉ LUIS ZARAGOZÁ CARBONELL. 2006. Ciencia y tecnología de polímeros. Ed. Universitaria Politec.Valencia

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Practica No. 7 Preparación de soluciones madre para los medios de cultivo

Objetivo Que el alumno obtenga un conocimiento práctico sobre los diversos métodos de preparación de medios de cultivo para propagar in vitro.

Fundamento teórico Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro": por ejemplo, se encuentran las sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como macronutrientes, las vitaminas tales como riboflavina, tiamina, piridoxina, ácido nicotínico, ácido pantoténico, biotina, y ácido fólico. Aminoácidos tales como L-glutamina, asparragina y cisteína, los hexitoles como mioinositol, hormonas y reguladores del crecimiento, una fuente de carbono y un agente gelificante. Un método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión. Las soluciones madre se conservan en frio y en bote color ámbar durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación. Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución. En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos. Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes.

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Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos: Botes de cristal o de plástico (preferiblemente de los primeros por su transparencia), que en algunos casos habrán de ser de color ámbar para proteger de la luz determinados compuestos que son fotosensibles. Balanza granataria Balanza analítica Espátulas de distinto tamaño para pesar Precauciones. Para medidas desde 0.01 g se utilizará la balanza granataria. Para valores inferiores la balanza analítica. Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se está haciendo la pesada. Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza, favor de colocar pesa sustancias. Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que esté limpia y seca. Es una precaución que evita la contaminación de los reactivos. Hay que tener la precaución de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tomó. Procedimiento Normas generales a la hora de preparar las disoluciones Si la disolución se va a remover con un agitador mecánico el mejor recipiente es un vaso de precipitados. Si la agitación es manual, suele ser mejor un erlenmeyer. - Antes de empezar a añadir los solutos se deberá poner un 70% del volumen total de agua - Cuando una disolución incluya más de un reactivo, estos se añadirán uno a uno y teniendo la precaución de no añadir uno hasta que el otro esté totalmente disuelto. - Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer. - Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren los siguientes datos: - Tipo de solución. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc - Grado de concentración. Ej 100 X (100 veces más concentrada que la solución final) - Componentes con fórmula y peso en g/l - Fecha de preparación - Nombre de los integrantes del equipo Equipo 1 Preparará 250 ml de la solución de macronutrientes del medio MS. Equipo 2 Preparará 250 ml de la solución de Calcio MS y 250 ml de la solución de Hierro y EDTA MS. En este segundo caso, se deberá poner en el recipiente donde se prepara la disolución un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y adicionar la solución de hierro. Cuando se haya disuelto, adicionar poco a poco y en agitación las sales de EDTA hasta su total disolución.

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Si es necesario, se puede calentar un poco la disolución. Guardar en frasco ámbar y colocar en refrigeración. Equipo 3 Preparará 250 ml de la solución de micronutrientes del medio MS. Equipo 4 Preparará 250 ml de la solución de vitaminas del medio MS. Equipo 5 Preparará 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A, B, C y D del medio DKW. Equipo 6 Preparará 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las hormonas del medio DKW. - La solución H se prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde se prepara la disolución un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y se adiciona la sal de hierro. Cuando se haya disuelto, se adicionan poco a poco y en agitación las sales de EDTA hasta su total disolución. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolución. Guardar en frasco ámbar en refrigeración. - Hormonas. Se prepararán 10 ml de cada una de las disoluciones. Para cada una de ellas se procederá del siguiente modo: Se pesará la hormona en el un tubo aforado. Se le añaden unas gotas de NaOH 1N y se disuelve. A continuación se va añadiendo poco a poco y agitando, agua destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf. Se rotulan cada uno de ellos y se guardan en el congelador. Equipo 7 Preparará 250 ml de la solución E Equipo 8 Preparará 250 ml de la solución F2. Primero se preparan 500 ml de la solución de biotina. De estos 500 ml, se toman 250ml y se les añade la cantidad correspondiente a 250 ml del resto de las vitaminas. Después de la explicación anterior, se prepararan las soluciones madre de las sales, vitaminas, aminoácidos y hormonas necesarias para los medios DKW y MS. Veamos la composición de cada uno de ellos: Lo más normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, de modo que la preparación de la solución final sea más rápida y tenga menos margen de error. Veamos la composición de cada una de las soluciones madre de ambos medios:

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Observaciones

Bibliografía ÁLVAREZ Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prácticas de Biotecnología Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz) DRIVER, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort. Science, 19(4). MURASHIGE, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiología Plantarum, 15, 473-497. REVILLA Bahillo, Ángeles y Ordás, Ricardo. Guiones de prácticas de Biotecnología Vegetal. Universidad de Oviedo

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Practica No. 8 Preparación de los Agares para cultivar in vitro.

Objetivo El estudiante tendrá conocimiento de la preparación de los agares para cultivar plantas in vitro a partir de las soluciones madre (practica 1), para con ello tenga mas claro el concepto de micro propagación de plantas para mejora biotecnológica.

Fundamento teórico El término “cultivo de tejido vegetal” implica una amplia gama de técnicas de cultivo tanto de órganos, como de tejidos y células e incluso plantas completas, entre las que se encuentra la micro propagación; la recuperación de embriones; la regeneración de plantas a partir del callo y la suspensión de células, así como el cultivo de protoplasma, anteras y microsporas, que se utilizan sobre todo para la multiplicación de plantas en gran escala (Segretin, 2006). Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes. Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos Autoclave Sacarosa Algodón Agar-Agar Frascos gerber Tubos de cultivo Ligas Papel aluminio Matraz de 1000ml Moscas magneticas Termoplato Campana de flujo laminar Agua destilada Etanol Soluciones madre del MS

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Procedimiento Para la preparación de los Agares para medio de cultivo para plantas: El medio de cultivo es el Murashige & Skoogque que consta de una amplia cantidad de nutrientes los cuales se muestra en la siguiente tabla: Para su preparación en 1000 mL se pesan las cantidades de cada uno de los compuestos o en su defecto si estos ya se tienen pre-pesados y en un frasco limpio por separado solo se agrega la cantidad adecuada según el volumen a preparar.

Agrega el agua destilada al matraz en que se preparara, disolver el medio ya pesado, agitar muy bien hasta observar cierto grado de solubilización. Agregar la sacarosa Ajustar el pH a 5.8 y agregar el agar-agar (0.8 % agar; 8 g /L y 30 g de sacarosa por litro). Someter a calentamiento con agitación sin que llegue a la ebullición. Proceda a vaciar el medio en frascos limpios y asegúrese de llenarlos con aproximadamente 50 mL, 2/4 del recipiente o según vea necesario. Meter a la autoclave para su esterilización (250 °F, 15 lb, 15 min). Pasado este periodo de esterilización, se sacan de la autoclave y se dejan enfriar y se meten a refrigeración o bien a una alacena limpia.

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Observaciones

Bibliografía KRIKORIA, A. (1990). Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación. Universidad de Nueva York. New York, E.U. 1-19 MROGINSKI, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de investigación de Biotecnología. Cali, Colombia. 1-22

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 9 Cultivo in vitro de plantas (semillas)

Objetivo Que el estudiante se familiarice con la siembra de semillas in vitro, que aprenda las técnicas para cultivos de tejidos, órganos vegetales y la obtención de callos a partir de secciones de zanahoria.

Fundamento teórico La biotecnología vegetal es “el cultivo in vitro de las plantas, en recipientes de vidrio”, y supone mantener las plantas en laboratorio, fuera de su entorno natural, teniendo como sustrato un medio de cultivo. En la composición del dicho medio se encuentran elementos minerales, agua, hormonas, sustancias orgánicas y vitaminas, siendo su porcentaje muy variable según las especies vegetales y pudiendo faltar alguno de estos componentes. La biotecnología actual se centra en la obtención de fármaco y vacunas y sobre todo en la obtención de nuevas especies y variedades con capacidad para soportar ataque de microorganismos o situaciones de estrés (salino, hídrico, etc.). Es de destacar la obtención de nuevos híbridos vegetales, por adición de ADN foráneo, obteniéndose los conocidos “organismos transgénicos”. Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes. Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos Campana de flujo laminar Estuche de disección; bisturí, pinzas grandes, pinzas pequeñas y tijeras. Frascos gerber con agar para plantas Tubos con agar para plantas Vasos de precipitados (7) Mecheros Alcohol Agua estéril Cloro Probetas Cajas petri

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Procedimiento Procedimiento 1: desinfección de semillas Para nuestra practica con semillas, se dispondrán de diversos tipos de semillas de cereales y frutos cítricos completos. Las semillas que se extraigan de los frutos ya están estériles (luego no hay que desinfectarlas), pero las semillas aisladas sí que hay que esterilizarlas (con dos agentes: cloro y alcohol). Los pasos a seguir para la desinfección son: 1. se deben envolver las semillas en paquetes para poder manipular con las pinzas y una vez hechos se procede a esterilizarlas. 2. Se sumergen en etanol durante 1 min 3. Se sumergen en solución de hipoclorito de sodio o cloro al 20% por 15 min. 4. Se enjuagan en tres vasos de precipitados con agua estéril, destilada, desionizada durante un par de minutos por cada vaso (7). Procedimiento 2: Siembra de semillas (área estéril) Una vez que se tienen en el 7mo vaso de precipitado de agua estéril, las semillas ya están listas para su siembra en tubos de ensayo o en frascos gerber, que tiene medio de cultivo para plantas adecuado. Para sembrar las semillas en los medios de cultivo se enciende el mechero, se lavan las manos hasta el medio brazo y después se remojan en etanol al 10% hasta que se seque inician la manipulación o bien utilizar guantes estériles. Después de eso toman el paquete de material estéril y las cajas de petri de vidrio, que nos servirá como mesa de trabajo. Con la ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de semillas sobre una caja de precipitados y se abre, con las pinzas se toman las semillas para depositarlas en el medio de cultivo. En el caso de los frutos de cítricos completos se procede a esterilizar el fruto entero pulverizando con alcohol y luego la flamea. En la campana de flujo laminar se abren los frutos (limón, naranja o mandarina) y se extraen las semillas con unas pinzas. Tras hacer una pequeña incisión en la cubierta se siembran en tubos o frascos gerber con el medio de cultivo adecuado.

Observaciones

Bibliografía Serrano G.M, Biotecnología vegetal, Madrid D.L Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Practica No. 10 Cultivo in vitro de plantas (órganos vegetales)

Objetivo El alumno aprenderá a realizar el montaje de un cultivo de tejidos vegetales a partir de explantes nodales.

Fundamento teórico El término genérico “cultivo de tejidos vegetales” involucra a diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales). Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias). Aspectos de seguridad e higiene Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes. Todo el material debe estar estéril antes y después de la práctica.

Materiales y reactivos Microscopio de disección Microscopio compuesto Muestra de hongo desarrollado en la caja petri Asa de platino Formol Porta y cubre objetos Cutex Azul o rojo colorantes Fibra de vidrio Etiquetas adheribles

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Procedimiento Para la obtención de explantos nodales, se deben de lavar los tallos seleccionados con abundante agua. Secar cuidadosamente con papel filtro. A continuación se pasa a eliminar las hojas de los tallos, cuidado dejar 2 cm del peciolo unido al tallo. Igualmente deben eliminarse las espinas (si las hubiera). Acto seguido se separa los entrenudos (que deben contener al menos una yema axilar) con ayuda de unas tijeras. Debemos conseguir porciones de tallo de unos 4-5 cm aproximadamente. Para la estilización de los explantos nodales, se envuelven en una gasa y se introduce en un bote que contenga 100 ml de la disolución desinfectante (hipoclorito de sodio o cloro al 20%) durante 10 min (agitar esporádicamente). Después se lava 3 veces en vasos de precipitado con agua estéril, ayudándose de unas pinzas largas. Una vez desinfectado el material vegetal se procede a la siembra en los frascos gerber o en tubos de ensaye con medio de cultivo. Para la siembra de los explantos nodales se enciende el mechero (todo en esterilidad) y se abre el paquete del material estéril y las cajas petri que nos servirá como mesa de trabajo. Con ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de explantos nodales sobre la caja petri, se abre y se toman con las pinzas, para depositarlas en el medio de cultivo. La introducción del material vegetal en los frasco gerber debe ser muy cerca de la llama y usando pinzas estériles.

Observaciones

Bibliografía Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de investigación de Biotecnología. Cali, Colombia. 1-22 Agrios G.N. 1998. Fitopatología, 3era Edición, México, 838 pp.

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FACULTAD DE QUÍMICA, UAEM PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 11 Obtención del colorante natural Betalaina a partir de cultivos vegetales de Beta vulgaris (betabel) Introducción Las Betalaínas (BL) son pigmentos vacuolares hidrosolubles presentes en las plantas del orden de las Centrospermas, como el Betabel (Beta Vulgaris). Están compuestos por las Betacianinas (BC) de color rojo y las Betaxantina de color amarillo, ambas con diversos epímeros, son pigmentos hidrosolubles con buenas características organolépticas para ser utilizados en productos lácteos, bebidas, confitería cosméticos y farmacéuticos, ya que imparten coloraciones que van del rojo al amarillo. Además su uso está aprobado por la FDA desde 1960 y en México la secretaria de salud permite su aplicación en alimentos y cosméticos.

Objetivo Obtener colorantes naturales (betalainas) por medio del cultivo in vitro de Beta vulgaris, como una técnica biotecnológica para la producción de pigmentos de uso industrial.

Fundamento teórico El uso del color es una necesidad estética de la humanidad y está inmersa en la historia de su desarrollo cultural. Los colorantes están presentes en casi todas las plantas. De éstos, unos son producidos directamente por la actividad fisiológica de las plantas, mientras que otros son producto de transformaciones artificiales de sustancias de procedencia vegetal. Los que se encuentran ya formados en la naturaleza, suelen estar disueltos o formando depósitos granulares en las células superficiales de las plantas. Los colorantes vegetales se hayan concentrados en las vacuolas celulares de un sin número de plantas, en donde a su vez sin encontrarse en estado puro, se asocian con otros principios como aceites, resinas, y en particular con los taninos que son de carácter astringente. Los colorantes naturales los podemos definir como “aquellos que se obtienen de la materia animal y vegetal sin proceso químico. Estos son principalmente colorantes mordientes, aunque se conocen unos de la tina de disolventes, de pigmentos, directos y de los tipos ácidos. No se conocen colorantes naturales del tipo sulfurado, disperso, azoico o en rama. A partir de la Beta vulgaris (betabel) se extrae la betalaina, pigmento natural presente en esta raíz que le confiere su color rojo característico y que se emplea en la industria agroalimentaria, cosmética y farmacéutica, para la obtención de un colorante denominado rojo de remolacha. Ante las restricciones impuestas por los organismos internacionales para regular el uso de colorantes de tipo sintético, renace la necesidad de usar colorantes de origen natural. En este contexto, el cultivo de células y tejidos vegetales es una excelente alternativa que puede ayudar en el conocimiento y desarrollo de nuevas variedades de plantas productoras de colorantes o de nuevos sistemas de producción, como lo es el cultivo masivo de células u órganos vegetales.

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El término CTV se refiere al cultivo in vitro de cualquier estructura viva de una planta, sean estas, células, un tejido o un órgano, bajo condiciones asépticas. El principio de CTV es simple: Primero, es necesario aislar una parte de la planta a la que se le denomina “explate”, este explante posee una potencialidad de diferenciación capaz de regenerar no solamente tejidos y órganos, sino también un individuo completo; segundo, se provee de un medio ambiente apropiado (medio de cultivo adecuado a condiciones físicas propias de cada especie, en el cual pueda expresar su potencial intrínseco o inducido) y tercero, el trabajo es realizado en condiciones asépticas, es decir, el medio de cultivo está libre de microorganismos contaminantes. Los primeros pasos de la metodología para la obtención de un metabolito por cultivo de tejidos, son similares a la micro propagación. Se utilizan plantas en principio seleccionadas para una elevada producción del metabolito en cuestión. Por consiguiente, se utilizan órganos o tejidos en los que se localiza la producción del metabolito, o en los que se encuentra su máxima concentración. Se establece el cultivo en condiciones asépticas, encontrando los medios y las condiciones más adecuadas. Después de la inducción del callo sobre el explante, se establece un cultivo de células en suspensión. En la mayoría de los casos, las sustancias de interés se almacenan en estructuras al interior de las células, lo que plantea la necesidad de desarrollar procesos en dos etapas, una para el crecimiento y la proliferación de las células vegetales, y otra para la producción del compuesto de interés y para, posteriormente, durante la fase de recuperación del mismo, lisar las células que contengan el metabolito. Aspectos de seguridad e higiene Son necesarias las condiciones de seguridad mínimas para el trabajo en el laboratorio, equipo de protección de uso personal, así como el orden y la compostura adecuada dentro del laboratorio.

Materiales y reactivos La práctica de realizará en tres sesiones Primer sesión: preparación del medio de cultivo MS

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Matraz erlenmeyer de 2L Probeta de 100mL Pietas de 5 y 10 mL Tubos de cultivo Frascos de gerber Agitadores magnéticos Parrillas eléctricas Matraz aforado de 100 mL Autoclave Algodón Segunda sesión: establecimiento de cultivos Semillas de betabel Probeta de 1L Agua destilada estéril Etanol Mechero de alcohol Bisturis Cajas petri estériles Pinzas de disección de 30 cm Sesión 3: Establecimiento de cultivos en Matraz erlenmeyer de 250 mL Agitador Espectrofotómetro y celdas Mecheros de alcohol Bisturís Cajas petri estériles desechables Pinzas de disección de 30 cm

Papel aluminio Ligas Solución Stock* Sacarosa Phytagel NaOH 1.0 N HCI 1.0 N Solución amortiguadora pH 4.0 Solución amortiguadora pH 7.0 Agua destilada de callo Vasos de precipitado de 0.5 y 1 L Campana de flujo laminar Cámara de incubación Cerillos Algodón Solución de NaCl al 10% Solución Jabonosa Tween 20 suspensión. Papel aluminio Campana de flujo laminar Ligas Cerillos Algodón Agua destilada Etanol

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Procedimiento Preparación de solución Stock macronutrientes y micronutrientes.

de

Composición y preparación Murashige y Skoog (medio MS)

de

Tabla 1. medio

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a base de los cotiledones y el segundo arriba donde comienza la raíz, de forma que obtenemos tres diferentes explantes, cotiledones, raíces e hipocotilos

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Los hipocotilos obtenidos serán transferidos a frascos con medio de cultivo fresco e incubados en las mismas condiciones qu

de cultivo, en condiciones asépticas y con ayuda de unas pinzas estériles sacar las plántulas del frasco y depositarlas en una caja petri estéril. Se colocan los frascos en incubación a 25 °C, con un fotoperiodo de 16 h de luz por 8 h de oscuridad.

Sesión 2: Establecimiento de cultivos de callo

l finalizar la esterilización, dejar enfriar para que el medio adquiera una textura gelatinosa.

Almacenar a 4°C.

Verter el contenido en los recipientes de cultivo y esterilizarlo. laspH semillas a los frascos conentre medio cultivo preparados en la primera sesión (5 semillas), tapar co ver la solución preparada al matraz, agitarTransfiera y ajustar el para que se encuentre 5.7de – 5.8. iles transfiera las semillas a una caja petri estéril, con ayuda de un bisturí, también estéril separe las semillas. Añadir 2 g de phytagel, agitar y calentar la solución hasta que el phytagel quede disuelto.

Verter el contenido d un matraz aforado de 1 L y aforar. Lavar las semillas de betabel con mucho cuidado, colocando las semillas en sol. jabonosa, agitando durante un min Adicionar 30 g de sacarosa y agitar hasta que se disuelva completamente. las semillas en la solución de cloro durante 10 min, decantar y lavar con H2O destilada (3 veces). Agregar 10 mL de solución stock de micronutrientes (MS x100). Añadir 5 mL de soluciones de hierro (MS x 200) y agitar. un matraz Anadir 100 mL de la solución stock de macronutrientes (MS A x10) y agitar.erlenmeyer de 2 L adicionar 500 mL de H2O destilada.

Sesión 1: Preparación del medio de cultivo Vitaminas (MS x200)

Micronutrientes (MS x100)

Macronutrientes (MS x10)

53 Cuestionario o hasta el final del experimento la biomasa, tomando alícuotas del medio y determinando su absorbancia a 450 nm. Graficar y determinar por regresión lineal la producción de betalainas.

tivos celulares se incuban en condiciones de oscuridadEn con cada agitación matrazde se 100 inoculan rpm (26.0 aprox.± 500 1.0 °C) a 750 mg de callo para asegurar la iniciación del cultivo.

condiciones de asepsia transferir el callo formado por Con los cultivos de hipocotilo a cajas petri. ayuda del bisturí se fragmenta el callo y únicamente se utiliza como inoculo el callo joven.

Preparar 1 L de medio liquido MS (igual que en la 1er sesión, excepto por la adición de phytagel). na vez aforado, vaciar 50 mL de medio en cada uno de los matraces erlenmeyer a utilizar.

Sesión 3. Establecimiento de cultivos en suspensión

Definir callo, morfogénesis y friabilidad ¿Qué características son deseables en un callo para la activación de un cultivo de células en suspensión? ¿el crecimiento de una suspensión de células vegetales puede caracterizarse al igual que los cultivos bacterianos? ¿Qué combinación y proporción de auxinas y citocinas utilizaría para promover la callogénesis en un cultivo determinado? En los cultivos de semillas in vitro, ¿es necesaria la presencia de azúcares en la formulación del medio de cultivo?

Observaciones

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Bibliografía DELGADO F. Jiménez A y Paredes O. 2000. Natural pigment: carotenoids, anthocyanins and betalaínas. Characteristics, biosíntesis, processing and estability. Crit. Rev. Food Sci. And Nut 40: (3): 173-289. ABDELNOUR, E. A. y Vincent, E. J., 1994. Conceptos básicos de cultivo de tejidos Vegetales, catie, Turrialba, costa rica pp. 38 HURTADO, M.D. y Merino, M.M., 1987. Cultivo de tejidos vegetalales. Trillas. México pp. 232

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 12 Bioinformática y biotecnología Introducción La biotecnología logró que una cantidad considerable de industrias dejaran de existir tal como las conocíamos. Es el caso de la farmacéutica, que tiene una rama “biofarmacéutica” que abarca la elaboración de tratamientos para diversas afecciones basadas en anticuerpos monoclonales y aspira a diseñar, en un futuro, drogas a medida. También está la industria biotecnológica per sé y la de los alimentos, hoy modificados para resolver los problemas de la cantidad producida y la adición de propiedades. La Bioinformática, una especialidad que a nivel mundial tiene apenas 15 años, es una disciplina muy innovadora que trata de utilizar el potencial del cálculo y las herramientas de computación para resolver problemas muy complejos de la biología, como por ejemplo, secuenciar genomas.

Objetivo Introducir las bases de datos accesibles a través de Internet de importancia en el área biológica. Comprender la utilidad de las mismas como herramientas de acceso a información y programas de cómputo actualizados.

Fundamento teórico En las últimas décadas, científicos alrededor del mundo se han dedicado a obtener las secuencias tanto proteínas como de ácidos nucleicos. Aunque en sus inicios estos esfuerzos fueron aislados, poco a poco la cantidad de datos generada se hizo excesiva para ser manejada por laboratorios aislados. Además, con el advenimiento de nuevas tecnologías de secuenciación, se generaron proyectos conjuntos entre laboratorios cuyo objetivo único era la secuenciación de un genoma en particular. Se hizo entonces necesaria la organización de bancos de datos donde las secuencias generadas pudieran ser depositadas. Desde el inicio, la comunidad científica estuvo de acuerdo en que estos bancos de datos deberían tener acceso libre a nivel mundial. Mucho antes de que el genoma humano se completara en el año 2003, (http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml), existían ya decenas de este tipo de bancos de datos. Actualmente, existen bancos de datos definidos, sumamente extensos de los cuales se derivan “secciones” donde se puede tener acceso a información más específica.

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Materiales Sala de Acceso a internet Acceso a las bases de datos genéticos Procedimiento Se visitarán diferentes sitios en Internet y su instructor le indicará las principales características de los mismos. Dependiendo del tiempo y el acceso a Internet, se revisarán los siguientes sitios: Dirección de la página web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? DB=pubmed

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ http://www.genome.jp/kegg/ http://www.ebi.ac.uk/embl/ http://www.webact.org/WebACT/home

http://www.sanger.ac.uk/Software/ACT/

Descripción Base de datos general, no solo de secuencias de macromoléculas sino también acceso a libros y revistas en el área de ciencias de la salud. Además, acceso a programas de cómputo para análisis de secuencias de proteínas, genes o genomas. Programa de cómputo que encuentra secuencias similares en proteínas y ácidos nucleicos Base de datos de Japón Base de datos Europeo Banco de datos de comparación de genomas de procariotas, que permite la visualización “on line” de hasta cinco genomas de forma simultánea, utilizando el herramienta de comparación Artemis, desarrollada por el Instituto Sanger. Herramienta de comparación de ADN Artemis

Cuestionario ¿Cuál son los objetivos de las bases de datos? En función de tu formación profesional ¿Cuál es la utilidad que encuentras al consultar las bases de datos sugeridas? ¿Qué importancia tienen el conocimiento de las bases de datos mundiales en tu carrera? Conoces bases de datos nacionales ¿Cuáles?

Observaciones

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Bibliografía Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 Romero UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 13. Extracción de ADN, PCR y técnicas electroforéticas (Laboratorio virtual WEB) Introducción Desde la década de 1950 y 1960, los biólogos moleculares han aprendido a caracterizar, aislar y manipular los componentes moleculares de las células y organismos. Estos componentes incluyen el ADN, el repositorio de información genética; ARN, un pariente cercano de ADN cuyas funciones abarcan desde que actúa como una copia de trabajo temporal de ADN a reales funciones estructurales y enzimáticas, así como una parte funcional y estructural del aparato traslación; y proteínas, el tipo de molécula en las células estructural y enzimática principal. La reacción en cadena de polimerasa es una técnica muy versátil para la copia de ADN. En breve, PCR permite una sola secuencia de ADN que se copien (millones de veces) o alterado de manera predeterminada. Electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la biología molecular. El principio básico es ADN, ARN, y proteínas pueden ser separadas por medio de un campo eléctrico. Gel de electroforesis en agarosa, ADN y ARN pueden separarse de tamaño ejecutando el ADN a través de un gel de agarosa. Objetivo Que el alumno obtenga conocimiento sobre los métodos actuales de extracción y análisis de ADN utilizando laboratorios virtuales encontrados en internet.

Fundamento teórico La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue descrita por primera vez en 1985 por Kary B. Mullis. Esta invención lo hizo acreedor en 1993 del Premio Nobel en Química, debido al gran impacto que ha tenido esta técnica en el área de la bioquímica. Su objetivo y función es la de obtener mediante amplificación in vitro cantidades “masivas” de ADN incluso a partir de muestras de ADN muy pequeñas. Para realizar el PCR más sencillo, se requiere conocer las secuencias que rodean la región a

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amplificar, luego se producen oligonucleótidos complementarios a estas secuencias mediante síntesis química automatizada y estos son utilizados como cebadores (primers) en una reacción de polimerización cíclica catalizada por la ADN polimerasa. La electroforesis es el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar. Esto porque la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleicos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la migración no solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el grado de super-enrollamiento que éste posea. Generalmente en una preparación de plásmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la forma super-enrollada, la forma semi relajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s).

Materiales Sala de Acceso a internet Acceso a las bases de datos genéticos Procedimiento

Realizar una detallada discusión sobre las técnica revisadas que incluya: Realizar diagramas de procedimiento técnico. Equipos utilizados Tipos y utilidad de los reactivos Fundamento de las técnicas Aplicación sobre la biotecnología farmacéutica. Consultar los laboratorios virtuales de la página http://learn.genetics.utah.edu/

Cuestionario A que se le denomina técnicas de biología molecular. Elabora una lista de herramientas de biología molecular utilizadas en la actualidad. ¿Menciona alguna aplicación de las técnicas revisadas de biología molecular para el desarrollo de productos farmacéuticos?

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Observaciones

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Bibliografía Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 Romero UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 14 Transformación bacteriana (Laboratorio virtual WEB) Introducción La transformación genética de bacterias es un procedimiento por el cual se introduce material genético a una bacteria. Existen otros procesos de inserción del material genético, que dependiendo del organismo receptor y el mecanismo, algunos reciben nombres como transfección o transducción. Generalmente, el material genético insertado es conocido como plásmido (DNA circular), pero pueden insertarse otras formas de material genético, como DNA o RNA. Los plásmidos utilizados para la transformación de bacterias contienen en general, uno o varios genes de interés, un gen reportero (que permite visualizar la transcripción del plásmido), y un gen de resistencia a un antibiótico, que permite seleccionar a la bacteria transformada de otras, por su capacidad de crecer en medio que contiene el antibiótico de resistencia.

Objetivo Que el alumno obtenga conocimiento sobre los métodos de transformación bacteriana utilizados en la actualidad y descritos en laboratorios virtuales encontrados en internet.

Fundamento teórico Aunque las bacterias se reproducen por un proceso asexual (fisión binaria), poseen mecanismos para lograr la variabilidad genética que necesitan para adaptarse a un entorno cambiante. En general existen dos formas de cambiar la dotación genética de una bacteria, las mutaciones y la transferencia de fragmentos de ADN de unas bacterias a otras con posterior recombinación de los fragmentos adquiridos en el cromosoma o en los plásmidos de las bacterias receptora. Uno de los procesos naturales de transferencia de material genético de una bacteria a otra, junto con la conjugación y la transducción, que es una integración directa del ADN. Experimentalmente consiste en hacer penetrar un fragmento de ADN en una bacteria para provocar en ella una recombinación genética. Por extensión (abusiva) se habla a veces de transformación para designar un proceso idéntico que afecta a las células eucarióticas (levaduras, células animales y vegetales). Las transformación tienen muchas aplicaciones, como la producción de proteínas, la producción de los mismos plásmidos, entre otros.

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Conocemos dos formas de recombinación: la recombinación homóloga y la transposición. En la recombinación homóloga el fragmento de ADN aceptado es muy similar a una parte del genoma del a bacteria y, tras situarse al lado, se intercambian con él por un mecanismo de rotura, entrecruzamiento y reunión de sus cadenas de ADN (figura 5). La transferencia previa a este tipo de recombinación puede ocurrir mediante tres vías: la penetración de ADN desnudo directamente a través de la pared de la célula receptora (transformación), mediante un bacteriófago que infecta diferentes poblaciones bacterianas (transducción), o por transferencia de plásmidos y en su caso de genes cromosómicos arrastrados por plásmidos desde las bacterias donadoras a las receptoras (conjugación) (figura 5).

Figura 5. Mecanismos de recombinación genética.

Materiales Sala de Acceso a internet Acceso a las bases de datos genéticos

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Procedimiento

Realizar diagramas de procedimiento técnico. Consultar los laboratorio virtual de la página: Realizar una detallada discusión sobre las técnica revisadas que incluya: Equipos utilizados Tipos y utilidad de los reactivos Fundamento de las técnicas Aplicación sobre la biotecnología farmacéutica.

Cuestionario Describe los principales mecanismos naturales de variabilidad genética de las bacterias. Describe los mecanismos in vitro para inducir variabilidad genética de las bacterias Menciona al menos dos aplicaciones en la industria farmacéutica de la variabilidad genética inducida en bacterias.

Observaciones

Bibliografía Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods.

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3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 Romero

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnología Farmacéutica Práctica No. 15. Obtención de penicilina y comprobación de su acción antibiótica Introducción Los antibióticos son por definición moléculas con actividad antimicrobiana, que incluyen una gran cantidad de compuestos pertenecientes a diferentes familias químicas. Son metabolitos secundarios, producidos en la mayoría de los casos después de la fase de crecimiento. Los primeros procesos para la producción de penicilina, que fue el primer antibiótico conocido, implicaban el crecimiento de Penicillium notatum sobre la superficie de un medio líquido (Czapek-Dox-glucosa). El período de incubación era usualmente de 6-12 días y posteriormente la penicilina se extraía con solventes previa separación del micelio. Objetivo Obtención de penicilina por inoculación de esporas de Penicillium chrysogenum previamente sembradas en agar sabouraud – en medio de cultivo liquido que contiene los nutrientes apropiados para la generación y crecimiento de la biomasa.

Fundamento teórico En la Figura 4 se muestra un esquema de la biosíntesis de penicilina. Las distintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogeizuin por adición de una apropiada cadena carboxílica en cantidad adecuada en el medio de cultivo, pero solamente tienen valor terapéutico la penicilina G y la V. Ambas tienen un espectro y actividad similar, pero la penicilina V es más estable a pH ácido, lo que permite su administración por vía oral. La producción de penicilina como otros procesos biotecnológicos está dominada por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que realizan permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada área del proceso: cepa, fermentación y separación. El proceso a grandes rasgos implica el cultivo de P. chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta una escala de 500.000 L, separación del micelio por filtración y extracción del antibiótico del caldo, seguida por la cristalización o precipitación ácida del mismo. Penicilina: fabricación industrial La fabricación de penicilina es un ejemplo del proceso típico de obtención de antibióticos. El hongo utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillum chrysogenum y es particularmente activo sobre el estafilococo, estreptococo y neumococo, así como sobre la mayor parte de los microorganismos Gram positivos, presentando escasa acción sobre los Gram negativos.

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Las 4 fases principales para la fabricación de penicilina son: Fermentación Separación del micelio del caldo fermentado y extracción de la penicilina por medio de disolventes Purificación con disolventes y formación de la sal sódica de la penicilina Ensayos de control y almacenamiento.

Figura 4. Ruta sintética de la penicilina Preparación: El caldo de cultivo para la fermentación se obtiene por infusión acuosa de maíz, añadiendo de un 2 a un 3% de lactosa, y también se adicionan compuestos inorgánicos conteniendo hidrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio, nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc. La adición de ciertos compuestos que favorecen el crecimiento del hongo debe evitarse, ya que podrían ser tolerados al administrar el producto, ni su eliminación sería económica. Después de buscar el pH a 4.5-5.0, el medio de cultivo se pasa al fermentador, que está equipado con un agitador vertical, con un sistema de introducción de aire esterilizado por filtración y con serpentines para mantener la temperatura deseada. El hongo se introduce por medio de conducciones estériles y con ayuda de airea presión. Durante el crecimiento el medio se esteriliza con vapor a presión, y la temperatura se mantiene entre 23 y 25°C. El aire estéril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitación facilita su uniforme distribución en el seno del líquido. Se requiere un volumen de aire por minuto y por volumen de medio de cultivo. El proceso se controla a intervalos que oscilan entre 3 y 6 horas; al cabo de unas 50 a 90 horas el crecimiento se va haciendo más lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por completo. La masa se enfría a 5°C a causa de la inestabilidad de la penicilina a la temperatura ambiente, y se separa el micelio en un filtro de tambor rotatorio. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas grandes dosis de penicilina; solamente un pequeño porcentaje de personas desarrollan alergia.

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Microorganismo Cultivo en agar inclinado de Penicillium chrysogenum (DSM 1.075) realizado en agar Sabouraudglucosa: glucosa: 40.0g, peptona: 10.0g, agar: 15.0g, agua corriente: 1L (pH 5.6) Aspectos de seguridad e higiene Son necesarias las condiciones de seguridad mínimas para el trabajo en el laboratorio, equipo de protección de uso personal, así como el orden y la compostura adecuada dentro del laboratorio.

Materiales y reactivos 1 jeringa desechable de 5 ml Agua estéril para inyección Algodón Gasa Espátula Pipetas estériles Asa de siembra Tubos de ensayo estériles Papel indicador pH (1-7) Embudo de vidrio con filtro redondo Mechero Bunsen Erlenmeyer de 500 ml Papel filtro Cajas petri inoculadas con Bacillus subitlis, Escherichia coli o Pseudomonas fluorescens Glucosa 2,0g Peptona 10,0g Extracto de levadura 1,0g Agar 12,0g Agua desmineralizada pH 7 NaCl (0.9 %, estéril)

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68 o de cultivo (lactosa: 30.0 g, glucosa: 10.0g, extracto de levadura: 40.0g, nitrato sódico: 3.0 g, dihidrogenofosfato sódico: 0.5g, fenilacetato sódico: 0.3

Ajustar a pH entre 5.5 y 6, tapar con algodón y esterilizar en autoclave.

Preparación del medio de cultivo Repicar Penicillium Chrysogenum en un tubo decrecer ensayo que contenga m Chrysogenum en un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud inclinado y dejarlo durante 8 días. agar sabouraud inclinado y dejarlo crecer

Preparación del inoculo Procedimiento

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Pasado el tiempo, comprobar la actividad de la penicilina por la aparición de halos de inhibición alrededor de los d una caja de petri, la cual previamente ha sido sembrada con un microorganismo sensible a la penicilina tlis, Escherichia coli o Pseudomonas fluorescens).

Incubar a 28 ºC por 24 horas. Impregnarlos con el filtrado del medio

Cortar con perforadora pequeños círculos de papel de filtro.

Evaluación de la actividad antimicrobiana Filtrar y recoger los cristales obtenidos.

Añadir un poco de solución de éter disuelto en trietilamina

Concentrar a vacío hasta reducir a 1/4 el filtrado

Añadir un volumen igual de éter enfriado en un baño de hielo Adicionar sulfato sódico anhidro en exceso (solo con la punta de la espátula)

Tomar el filtrado y ajustar el pH a 2.0 con ácido fosfórico. Filtrar el caldo de cultivo

Cristalización de la penicilina Lleve el medio al agitador orbital controle el pH cada 2 ó 3 días manteniéndolo a pH 5, durante 10 a 15 d

e 5 ml, agua estéril para inyección, aspersor con alcohol, gasa y mechero; encender el motor de la cabina y la lámpara germicida y dejar durante 20 minu Realice el mismo procedimiento con 5 ml más y tape con el algodón. Agite un poco con cuidado de no regar nada y luego adicionar en el erlenmeyer donde se encuentra el m

Coloque 5ml de agua inyectable con la jeringa y descárguelos sobre el tubo donde se encuentra el inoc

Inoculación del medio de cultivo

Cuestionario En la industria farmacéutica es necesario el mantenimiento de las cepas de Penicillium, ¿Cómo es este procedimiento? ¿Cuál es el significado de las unidades de medida de la penicilina? Menciona los métodos por los cuales la industria farmacéutica puede incrementar la producción de penicilina. Además de glucosa y lactosa las cepas de Penicillium utilizan una gran variedad de fuentes de carbono y energía, en base a tu revisión bibliográfica menciona algunas de gran importancia.

Observaciones

Bibliografía COOMBS, J. Diccionario de biotecnología. Editorial Labor, S.A. 1ª edición 1989. España. CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiología Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza España.

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3ª edición. 1989. JAGNOW, Gerhard. Biotecnología “Introducción con experimentos modelo”. Editorial Acribia S.A. Programación semestral Agosto 2013 – Enero 2014 Práctica

Fecha

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