Manual de Practicas de Genomica y Proteomica

UNIVERSIDAD ANÁHUAC DE OAXACA ESCUELA DE MEDICINA Y CIRUGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS 2019 MANUAL DE PRACTICAS 2019 TABLA

Views 65 Downloads 0 File size 280KB

Report DMCA / Copyright

DOWNLOAD FILE

Recommend stories

Citation preview

UNIVERSIDAD ANÁHUAC DE OAXACA ESCUELA DE MEDICINA Y CIRUGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS

2019

MANUAL DE PRACTICAS 2019

TABLA DE CONTENIDO PRACTICA 1. MEDICION DE VOLUMENES

3

PRACTICA 2. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

5

Página 2 de 6

MANUAL DE PRACTICAS 2019

PRACTICA 1. MEDICION DE VOLUMENES Objetivos 1. Desarrollar habilidades en el manejo de los instrumentos del laboratorio para así poder analizar las diferencias en exactitud y precisión de materiales volumétricos. 2. Identificar con exactitud los materiales que se utilizan en el laboratorio para medir volúmenes 3. Realizar diferentes mediciones de volúmenes de líquidos Materiales de laboratorio                   

Probeta 100 ml 2 Basos de precipitados Butera Matraz de Erlenmeyer Pera de succión (básica y de seguridad) Soporte universal Pinzas para bureta Pipeta volumétrica (graduada y aforada) Matraz aforado 100 ml Embudo de vidrio Tubo de vidrio Piseta con agua Cloruro de sodio Puntas para micropipetas Papel aluminio Micropipetas 1 ml, 200 µl y 10 µl Cloruro de calcion Agitador magnético Imanes para agitador

Procedimiento 1. Identificación de todos los materiales y sus características. 2. Medición de diferentes volúmenes de agua con la pipeta y perilla de seguridad. 3. Realizar la lectura del líquido en la probeta teniendo en cuenta la manera correcta de realizar la medida. 4. Practicar la medida de volúmenes con micropipeta. 5. Preparar 100 ml de una disolución de NaCl a 0.3 M usando un matraz aforado. 6. Preparar 100 ml de una solución al 10% (m/v) de NaCl. Página 3 de 6

MANUAL DE PRACTICAS 2019

7. Preparar 100 ml de una solución 0.15 N de CaCl2. 8. Preparar 1 ml de una solución a 1000 ppm de NaCl. Evidencia 1. ¿Cuándo trabajar en la campana de extracción? 2. ¿Qué líquidos son peligrosos al momento de medir su volumen? 3. ¿Por qué no utilizamos para medir volúmenes el Erlenmeyer o el Beaker? 4. ¿Qué volumen es más exacto, el medido con una pipeta aforada o el medio con una pipeta graduada? 5. Calcula la concentración molar de una solución de 2 g de NaCl en 100 ml de agua.

6. Determina la densidad de un sólido irregular. Describe el procedimiento que usaste.

Página 4 de 6

MANUAL DE PRACTICAS 2019

PRACTICA 2. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Introducción La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación de la unión de un colorante, el Azul de Coomassie G-250, a la proteína, comparando esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar (Albúmina de Suero Bovino (BSA)). La cuantificación se hace midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro, a 595 nm, y graficando la absorbancia contra la concentración de proteínas, obteniendo una curva de calibración de la proteína estándar. Con esta curva de calibración, se puede interpolar la concentración de proteínas en una muestra al medir su absorbancia a 595 nm. Objetivos Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros. Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. Construir curvas de calibración y comprender su importancia. Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estándar. Materiales y reactivos            

Reactivo de Bradford Agua destilada Estándar de proteína (BSA al 22%) Espectrofotometro Cubetas para espectrofotómetro Metanol o etanol Vaso de precipitado 10 tubos de ensayo Piseta Micropipetas y puntas Vortex gradilla

Procedimiento 1. Prepare una disolución de BSA a 0.5 mg/ml a partir del reactivo de BSA al 22%. 2. Prepare diluciones de BSA de 25, 50, 75 y 100 µg/mL para lo cual en 4 tubos de ensayo añada 5, 10, 15 y 20 µL del estándar de proteína (0.5 mg/mL) y añada agua para completar el volumen a 100 µL. Realice las diluciones por duplicado.

Página 5 de 6

MANUAL DE PRACTICAS 2019

3. En otro tubo añada 100 µL de la solución de dilución (agua). Este es el blanco. 4- Prepare la(s) muestra(s) tomando un volumen igual o menor a 100 µL; completando los 100 µL con la solución. Prepare varias diluciones de la muestra para asegurar que la concentración de proteínas quede entre el rango adecuado. 5- Añada a cada tubo 1 mL del reactivo de Bradford, mezcle con agitador vórtex, e incube la reacción a temperatura ambiente por 2 minutos. 6- Mida la absorbancia a 595 nm (A595) en un espectrofotómetro, en un plazo no mayor de 1 hora. 7- Haga la curva de calibración estándar graficando la A595 contra la concentración de proteína estándar. 8. Lave la cubeta con metanol y agua destilada entre cada medición. 9- Determine la concentración de proteína en las muestras a partir de la curva de calibración estándar y los valores de A595. Si la concentración es muy alta (queda fuera del rango del estándar), diluya la muestra o tome una alícuota menor para la determinación. Evidencia. 1. Investiga qué factores contribuyen en la desviación de la línea recta al graficar la absorbancia contra concentración (desviaciones a la ley de Beer). 2. ¿Cuáles son los principales métodos colorimétricos usados en la determinación de Proteínas? 3. ¿Qué sustancias pueden interferir con la determinación de proteínas por el método de Bradford? 4. Investiga cuál de los siguientes métodos es más sensible y menos costoso para determinar la concentración de proteínas de una muestra: Lowry, Absorbancias 280 nm y Bradford. 5. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de estos métodos (Lowry, Absorbancias 280 nm y Bradford.)? 6. ¿Por qué no se puede utilizar el método de Bradford para medir la concentración de péptidos como la oxitocina, las endorfinas o la somatostatina? 7. De acuerdo con tus resultados, ¿cuál es el intervalo en el que se podría determinar la concentración de una proteína en una muestra utilizando la curva estándar de determinación de proteínas por Bradford? Da una explicación. 8. ¿Cuáles son las aplicaciones de una curva de calibración o estándar? 9. Construya la curva estándar de los datos que obtuvo usando un programa y obtenga el coeficiente de correlación de Pearson entre la absorbancia y la concentración. 10. Encuentre la recta que se ajusta a los datos usando la recta de regresión lineal simple o ajustando una función logarítmica. A partir de la función ajustada obtenga la concentración de la muestra problema. 11. Investiga los fundamentos del espectrofotómetro de absorción y espectrofotómetro de emisión. 12. Identifica las partes y el fundamento de un espectrofotómetro.

Página 6 de 6