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• Adrian Lazaro Frias

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PRÁCTICAS DE PROTEÓMICA GRADO EN BIOTECNOLOGÍA CURSO 3º

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NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD Consideraciones previas. En cada laboratorio es necesario prever que cualquier incidente que pueda afectar al funcionamiento de la Universidad, tenga una incidencia nula o mínima sobre las personas, las instalaciones y/o la continuidad de las actividades. La organización del laboratorio debe permitir la correcta gestión de la prevención del riesgo, imbuida en los propios procedimientos de trabajo, prácticas y actividades. Cualquier persona que realice sus actividades en el laboratorio debe conocer: Reglamento de funcionamiento del laboratorio. Riesgos para la seguridad y la salud de los productos químicos existentes. Riesgo biológico de los agentes biológico empleados. Manual de Autoprotección de emergencias de la UMH. Itinerarios y salidas de emergencia generales y particulares. Localización y señalización de lavaojos y/o duchas de seguridad, extintores (su funcionamiento y adecuación) e interruptores de suministro eléctrico. Localización de los botiquines. Riesgos para el medio ambiente de los productos químicos existentes. En esta introducción se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio, para lo cual se le indicarán las normas generales de comportamiento en el mismo, las reglas de seguridad que hay que observar, las normas específicas en caso de accidente, así como las normas generales para la realización de las prácticas de la asignatura. Normas generales del laboratorio 1. El alumno tiene la obligación de leer y estudiar con anticipación las experiencias a realizar en el laboratorio. El fundamento teórico, si lo desconoce, deberá buscarlo en los libros adecuados. 2. A la hora señalada para el comienzo de las prácticas el alumno deberá estar en el lugar correspondiente y en su puesto. Será obligatorio usar una bata blanca. No disponer de la bata blanca implica no poder realizar la práctica de ese día. 3. Durante el horario de prácticas no se podrá salir del laboratorio sin permiso del profesor. 4. Está prohibido realizar pruebas diferentes a las indicadas en este cuaderno de prácticas. El alumno se ceñirá escrupulosamente al mismo. 5. Se valorará la actitud y el comportamiento general que cada alumno adopte durante la realización de las prácticas, aspecto éste determinante de la nota final. Reglas de seguridad Cuando se trabaja en el laboratorio, tanto de prácticas como de investigación, uno se puede exponer a una serie de sustancias cuya característica más importante, desde el punto de vista de la seguridad, es su toxicidad y peligrosidad. Una actitud de vigilancia y atención es imprescindible en todo momento, aunque no se esté haciendo nada. Pensar y actuar de forma segura es parte integral de la educación química. No debe realizarse ningún experimento antes de estar seguro de que se comprende bien lo que se va a hacer, y tras dar respuesta a estas dos preguntas: ¿Qué es lo peor que puede pasar? ¿Cómo lo puedo solucionar? Preguntar a los profesores, en caso de duda, es una buena costumbre. Para evitar accidentes e incidentes desagradables es necesario el extremar

las precauciones. El seguimiento estricto de las siguientes normas evitará al máximo la posibilidad de accidentes en el laboratorio. 1. En primer lugar mantener en todo momento las batas y los vestidos abrochados (protección frente a salpicaduras y derrames). 2. No llevar pulseras, colgantes o mangas anchas que puedan engancharse en los montajes. Deberán lavarse las manos antes y después de entrar y salir del laboratorio y siempre que hubiera contacto con algún producto químico. 3. Se evitará llevar, pantalón corto, faldas cortas, sandalias, zapatos abiertos, etc.; por razones de protección de la piel. 4. En el laboratorio está prohibido comer, beber o fumar. No se debe encender ninguna llama ni mechero en el laboratorio. 5. No conectar aparatos eléctricos sin asegurarse de que no hay peligro de vapores de disolventes próximos. No colocar jamás productos inflamables cerca de fuentes de calor. Muchas sustancias orgánicas inflamables originan vapores más densos que el aire, capaces de desplazarse distancias considerables por encima de la mesa de laboratorio. 6. Se tomarán las precauciones necesarias al trabajar con ácidos, bases o sustancias peligrosas para evitar accidentes. Si se utilizan sustancias en forma de polvo fino, se deberá de utilizar mascarilla fundamentalmente en el momento de la pesada para evitar su inhalación. Como norma general, para pipetear disoluciones o sustancias nocivas líquidas o en caso de duda, se utilizará una propipeta. Los disolventes orgánicos no se verterán por las pilas, sino que se almacenarán en los recipientes dispuestos para tal fin. Los ácidos y bases concentrados se neutralizarán, y la disolución salina resultante se verterá con los grifos abiertos. 7. Una norma general para la preparación de disoluciones de ácidos fuertes es que siempre se adicionará el ácido sobre el agua o disolución acuosa, al fin de evitar la proyección de esta última como consecuencia del calentamiento brusco al mezclarse ambas disoluciones. Si fuera necesario calentar el contenido de un tubo de ensayo a la llama, se hará con el tubo algo inclinado, agitando suavemente y con la boca del tubo dirigida hacia un lugar en que no haya ninguna persona. 8. Evitar el contacto físico con disolventes orgánicos. No respirar vapores de disolvente. (Ver apartado sobre "riesgos asociados a los disolventes"). Cuando se utilicen sustancias volátiles (disolventes orgánicos como el cloroformo, éter, etc.) se manipularán en la campana de gases utilizando, si es necesario, una mascarilla. 9. Las gafas de protección son obligatorias cuando el profesor así lo indique. No usar nunca lentes de contacto (los vapores orgánicos podrían dañarlas; por otro lado, los reactivos cáusticos no pueden ser eliminados del ojo si las lentillas están puestas). Fíjate dónde están situados los baños lavadores de ojos. 10. Usar guantes protectores cuando el profesor lo indique. En caso de contacto de productos corrosivos o irritantes ver indicaciones más abajo. 11. El material del laboratorio ha de estar siempre limpio y seco, sin restos de sustancias anteriores. Los residuos se tratarán de la siguiente forma: A) Material de cristal roto, papeles y otros. Se tirará en los recipientes destinados especialmente a este fin. B) Productos químicos tóxicos. Se tirarán en contenedores especiales para este fin. No tires directamente al fregadero los productos especialmente tóxicos. C) Sustancias líquidas o disoluciones. Los que puedan verterse al fregadero, se diluirán previamente, sobre todo si se trata de ácidos y de bases. No tires al fregadero productos o residuos sólidos que puedan atascarlas. En estos casos deposita los residuos en recipientes adecuados.

En el caso que se genere un derrame de residuos peligrosos durante la realización de la práctica, el papel que se utilice para su recogida también será depositado en el contenedor establecido para ese grupo de residuos peligrosos. En caso de duda, preguntar a algún responsable cómo proceder. 12. Una norma general que se añade a las citadas y que contribuye a la seguridad en el laboratorio es la del rigor y orden en el laboratorio. Con ello queremos resaltar que en todo momento se ha de mantener una limpieza y orden adecuados en el laboratorio. 13. Ante cualquier duda o si se produce algún accidente, avisar rápidamente al profesor. Normas de actuación Orden y limpieza. El orden es fundamental para evitar accidentes. Mantener el área de trabajo ordenada, sin libros, abrigos, bolsas, exceso de botes de productos químicos y cosas innecesarias o inútiles. Mantener las mesas siempre limpias. Se tienen que limpiar inmediatamente todos los productos químicos derramados. Limpiar siempre perfectamente el material y aparatos después de su uso. Responsabilidad. Trabajar sin prisas, pensando en cada momento lo que estás haciendo, y con el material y reactivos ordenados. No se debe gastar bromas, correr, etc. en el laboratorio. No realizar un experimento no autorizado. Un comportamiento irresponsable puede ser motivo de accidentes no deseados y comportar la expulsión inmediata del laboratorio. Atención a lo desconocido. No utilizar ni limpiar ningún recipiente de reactivos que no lleve etiqueta. Entregadlo inmediatamente al profesor. No sustituir nunca, sin autorización previa del profesor, un producto químico por otro en un experimento. No utilizar un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. No usar una pipeta directamente con la boca, sino a través de un sistema de aspiración. Manipulación del vidrio. No forzar un tubo de vidrio, ya que, en caso de ruptura, los cortes pueden ser graves No usar nunca equipo de vidrio que esté agrietado o roto. Depositar el material de vidrio roto en un contenedor para vidrio, no en una papelera. Manipulación de productos químicos. - Los productos químicos pueden ser peligrosos por sus propiedades tóxicas, corrosivas, inflamables o explosivas. Muchos reactivos, particularmente los disolventes orgánicos, arden en presencia de una llama. Transporte de reactivos. No transportar innecesariamente los reactivos de un sitio a otro del laboratorio. Las botellas se transportan siempre cogiéndolas por el fondo, nunca del tapón. Actuaciones en caso de accidente 1. En caso de accidente, avisar inmediatamente al profesor. En caso de gravedad llamar al 112, o al teléfono de la universidad 8665. No llevar a cabo actuaciones inseguras; si se realizan primeros auxilios, hay que estar seguro/a de no empeorar el estado del accidentado (protección) y asegurarse uno mismo de no sufrir riesgo (autoprotección). 2. Fuego en el laboratorio. Evacuad el laboratorio, de acuerdo con las indicaciones del profesor y la señalización existente en el mismo. Si el fuego es pequeño y localizado, apagadlo utilizando un extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo sofoque. Retirad los productos químicos inflamables que estén próximos fuego. No utilizar nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente. En caso de que el fuego sea importante, accionar el pulsador de alarma

3. Fuego en la ropa. Si se incendia la ropa, pedir ayuda inmediatamente. Tumbarse en el suelo y rodar sobre ti mismo para apagar las llamas. No correr (al hacerlo se aviva el fuego) ni intentar llegar a la ducha de seguridad si no está muy cerca. Ayudad a alguien que se esté quemando. Cubridle con una manta anti fuego, conducidle hasta la ducha de seguridad, si está cerca, o hacedle rodar por el suelo. No utilizar nunca un extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona tendida, procurando que no coja frío y proporcionarle los primeros auxilios hasta la llegada de la asistencia médica. 4. Quemaduras. Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o mantas calefactoras, etc., se trataran lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos. Desinfectar (por ej. con yodo) y cubrir con gasas. No aplicar ungüentos o sustancias (pasta de dientes, lejía, etc.) ni punciones o retirar las ampollas si aparecen. Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata. 5. Cortes. Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el laboratorio. Se deben lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como mínimo. Si son pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, lavadlos con agua y jabón, aplicar un antiséptico y taparlos con una venda o apósito adecuados. Si son grandes o muy profundos y no paran de sangrar, solicitar asistencia médica inmediata. No retirar ni manipular un posible cuerpo extraño enclavado. 6. Actuación en caso de inhalación de productos químicos. Conducir inmediatamente a la persona afectada a un sitio con aire fresco. Requerir asistencia médica inmediata. Al primer síntoma de dificultad respiratoria debe iniciarse la respiración artificial boca a boca. Identificar, si es posible, el gas causante, usar la máscara adecuada y si no la hay, aguantar la respiración mientras se extingue el vapor (abriendo ventanas, usando campanas, etc.). Tratar de no exponerse en cualquier caso. 7. Actuación en caso de ingestión de productos químicos. Antes de cualquier actuación concreta pedir asistencia médica. Si el paciente está inconsciente, ponerlo tumbado, con la cabeza de lado. Taparlo con una manta para que no tenga frío. No dejarlo sólo. No darle líquidos, ni provocar el vómito. 8. Derrame o proyección de productos químicos sobre la piel. Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimo durante 15 minutos. En el caso de productos corrosivos, además de lo anterior, también se retirará o cortará lo más rápidamente posible la ropa, evitando salpicaduras a otras partes del cuerpo. Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en un fregadero. Es necesario sacar toda la ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible mientras esté bajo la ducha. Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión de la herida. Proporcionar primeros auxilios hasta la llegada de asistencia médica a la persona afectada. Avisar a tu profesor. Si un producto químico entra en contacto con tus ojos, el tiempo es esencial, sobre todo si el producto es corrosivo (actuad en menos de 10 segundos). Cuanto antes se lave el ojo, menos grave será el daño producido. Lava los dos ojos con agua corriente abundante durante 15 minutos como mínimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco para lavar los ojos. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los párpados. Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión. Cuidado: no usar demasiada potencia de chorro de agua, para evitar lesiones al ojo.

Normas generales para la realización de las prácticas 1 Antes de comenzar la práctica deberá revisar que dispone de todo el material y productos necesarios para la misma, y que se encuentra todo limpio y en orden. Se notificará al profesor cualquier anomalía. Al finalizar la práctica dejará todo el material perfectamente limpio y ordenado, avisando al profesor de haber terminado antes de abandonar el laboratorio. 2 Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas. Pipetear siempre con la propipeta adecuada. No pipetear entre varias personas. 3 Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente etiquetados y cerrados, evitando que se confundan los tapones. Los recipientes donde se almacenan sustancias y disoluciones se deben marcar adecuadamente utilizando rotuladores, lápices de cera o etiquetas. En cada caso se indicará la sustancia de que se trata y su concentración, así como la fecha de preparación. 4 Se deben de anotar en el cuaderno de prácticas las disoluciones preparadas y su concentración, así como el volumen preparado de cada una. 5 Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados deberán situarse en el fondo de la bancada o mesa de trabajo, evitando dejarlos en los bordes. 6 Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un grupo de varias personas) deberá presentar un informe de resultados de cada práctica en la forma indicada por el profesor. 7 Ante cualquier duda preguntar al profesor de prácticas. 8 Se recuerda que para APROBAR la asignatura es necesario superar las prácticas. Las prácticas son obligatorias y la no asistencia a las mismas, salvo causa de fuerza mayor, implica la necesidad de superarlas en una PRUEBA TEÓRICA Y/O PRÁCTICA, DE ACUERDO CON LAS DIRECTRICES DE LA ASIGNATURA. Riesgos asociados a los disolventes Es esencial recordar que la mayoría de los disolventes orgánicos son inflamables, y arden si están expuestos a una llama. Además, muchos son tóxicos o carcinógenos. Por ejemplo, muchos disolventes clorocarbonados, si se acumulan en el organismo, causan un deterioro del hígado similar a la cirrosis originada por uso excesivo de etanol. El cloroformo y el éter son anestésicos, causando somnolencia y náuseas. En otras palabras, los disolventes orgánicos son tan peligrosos como los compuestos químicos corrosivos (p. ej. el ácido sulfúrico). A continuación se citan algunos ejemplos: • Ácido acético glacial: es suficientemente corrosivo para causar quemaduras. Sus vapores pueden irritar los ojos y los conductos nasales. • Acetona: no es muy tóxica comparada con otros disolventes. Sin embargo es MUY inflamable. • Benceno: se absorbe fácilmente a través de la piel, y puede afectar a la médula ósea y provocar leucemia. Está considerado como agente carcinógeno y afecta al hígado y los riñones. Además es muy inflamable. • Diclorometano: no es inflamable y no está considerado como carcinógeno. Si se ingiere puede deteriorar el hígado, y sus vapores pueden originar somnolencia y náuseas. • Etanol: es un conocido agente tóxico y es extremadamente inflamable. • Éter etílico: es extremadamente inflamable y puede originar explosiones (presencia de peróxidos). No es particularmente tóxico, pero en grandes concentraciones puede originar somnolencia y náuseas.

• Hexano, pentano, éter de petróleo: pueden irritar el tracto respiratorio y la piel. También pueden actuar como tóxico y depresivos del sistema nervioso central. Son altamente inflamables. • Metanol: más tóxico que el etanol, provoca por ingestión ceguera y muerte. Es muy inflamable. • Tolueno: no está considerado como agente carcinógeno, pero es tan tóxico como el benceno. Puede actuar como anestésico, y afectar al sistema nervioso central.

He leído y entiendo las Normas de Seguridad y los Riesgos Asociados al laboratorio

Nombre:_________________ _____________ Apellidos: _____________________________ DNI: _________________________________ Curso Académico:__________ ____________ Grado:___________________ _____________

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NORMAS ESPECÍFICAS EN CASO DE ACCIDENTE 1) En caso de que ocurra cualquier accidente AVISA, o haz avisar, inmediatamente AL PROFESOR DE PRÁCTICAS más cercano. Si se precisa ayuda externa recordar que el teléfono de emergencia de la Universidad es: 966 658665 (8665 para llamada interna). 2) Si un producto químico entra en contacto con tus ojos, corre al baño lavador de ojos más próximo, y lávalos con abundante cantidad de agua. Ten cuidado de no usar demasiada potencia de chorro de agua, para evitar lesiones al ojo. Avisa, o haz avisar, inmediatamente al profesor de prácticas más cercano. 3) Si se declara un incendio, el mejor consejo es apartarse de él y dejar que el profesor de prácticas se encargue de la situación. No te dejes dominar por el pánico, ¡razona!. Si el fuego es pequeño puede apagarse poniendo encima una manta ignífuga. Si el fuego está concentrado en el interior de un matraz o vaso de precipitados, puede ser asfixiado simplemente tapando la boca del matraz/vaso de precipitados con un vidrio de reloj o un vaso más grande. Si estas soluciones no funcionan, o si el fuego es de amplias proporciones hay que recurrir a los extintores de CO2. Nunca uses agua. Siempre avisa, o haz avisar, inmediatamente al profesor de prácticas más cercano. 4) Si tu ropa se incendia no corras (avivarías las llamas). Avanza decididamente hacia la manta ignífuga o ducha más cercana. Envolver la zona en llamas con la manta bastará para zanjar el incidente. Avisa, o haz avisar, inmediatamente al profesor de prácticas más cercano. 5) Si sufres pequeñas quemaduras por haber tocado objetos calientes "refrigera" la zona con abundante agua fría. Acude a un profesor de prácticas, pues en el botiquín hay cremas para estos casos. 6) En caso de quemadura por producto químico, este habrá de ser neutralizado. Si el responsable ha sido un ácido se puede emplear una disolución diluida de bicarbonato sódico; en caso de haber sido una base, se puede usar ácido acético al 2%. Avisa, o haz avisar, inmediatamente al profesor de prácticas más cercano. 7) En caso de corte, lavar la herida con abundante agua. Avisa, o haz avisar, inmediatamente al profesor de prácticas más cercano. Riesgos asociados a los disolventes Es esencial recordar que la mayoría de los disolventes orgánicos son inflamables, y arden si están expuestos a una llama. Además, muchos son tóxicos o carcinógenos. Por ejemplo, muchos disolventes clorocarbonados, si se acumulan en el organismo, causan un deterioro del hígado similar a la cirrosis originada por uso excesivo de etanol. El cloroformo y el éter

son anestésicos, causando somnolencia y náuseas. En otras palabras, los disolventes orgánicos son tan peligrosos como los compuestos químicos corrosivos (p. ej. el ácido sulfúrico), aunque manifiestan sus efectos de manera más soterrada. A continuación se citan algunos ejemplos: • Acido acético glacial: es suficientemente corrosivo para causar quemaduras. Sus vapores pueden irritar los ojos y los conductos nasales. • Acetona: no es muy tóxica comparada con otros disolventes. Sin embargo es extremadamente inflamable. • Benceno: se absorbe fácilmente a través de la piel, y puede afectar a la médula ósea y provocar leucemia. Está considerado como agente carcinógeno. También afecta al hígado y los riñones. Además es muy inflamable. Siempre se sustituirá por tolueno. • Diclorometano: no es inflamable y, a diferencia de otros disolventes clorocarbonados, no está considerado como carcinógeno. Es menos tóxico que el cloroformo y el tetracloruro de carbono, aunque si se ingiere puede deteriorar el hígado, y sus vapores pueden originar somnolencia y náuseas. • Etanol: es un conocido agente intoxicante y es extremadamente inflamable. • Eter etílico: es extremadamente inflamable (está considerado como el disolvente habitual más inflamable que existe, debido a su volatilidad y a que sus vapores son más densos que el aire) y puede originar explosiones (debido a la presencia de peróxidos). No es particularmente tóxico, pero en grandes concentraciones puede originar somnolencia y náuseas. • Hexano, pentano, éter de petróleo: pueden irritar el tracto respiratorio y la piel. También pueden actuar como intoxicantes y depresivos del sistema nervioso central. Son altamente inflamables. • Metanol: es más tóxico que el etanol, pudiendo provocar, por ingestión, ceguera y muerte. Es extremadamente inflamable. • Tolueno: no está considerado como agente carcinógeno, pero es tan tóxico como el benceno. Puede actuar como anestésico, y afectar al sistema nervioso central.

Grado en Biotecnología. Curso 3º. PROTEÓMICA PRÁCTICAS DE LABORATORIO. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Profesores: Mª Isabel Martínez-Lacaci y Vicente Micol

Electroforesis Bidimensional de Proteínas (2DE) 1. Introducción La combinación de las técnicas de isoelectroenfoque y la electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS) supone una técnica poderosa para conseguir separaciones de mezclas complejas de proteínas. Los geles de isoelectroenfoque en tubo o en capilar han sido utilizados clásicamente pero presentan problemas relacionados con la difusión del gradiente de pH o la variabilidad en su formación. En cambio, el uso de las tiras de gel en gradiente de pH inmovilizado (IPG strips) elimina estos problemas. Estas tiras están compuestas por derivados de acrilamida tamponada con grupos carboxilo y aminas terciarias que están copolimerizados en la red de acrilamida. A diferencia de los clásicos anfolitos, este gradiente de pH no difunde durante la electroforesis obteniéndose separaciones de isoelectroenfoque bastante reproducibles y baratas. En la presente práctica se pretende la familiarización del alumno con la utilización del equipo Protean® IEF cell (Biorad) y el manejo correcto de las tiras de poliacrilamida para realizar con éxito una electroforesis bidimensional (2DE). Las muestras a utilizar serán proteínas extraídas de un cultivo de una cepa de Escherichia coli (CECT 515) que se lisarán para la extracción de la proteína, y serán comparadas con un patrón de proteína de E. coli de fuente comercial.

2. Material y Reactivos Material - Micropipetas y puntas - Pipetas de vidrio - Gradillas - Tubos Corning - Probetas - Vaso de precipitados - Peso - Centrífuga - Sonicador de baño - Vortex - Espectrofotómetro - Cubetas - Tubos de vidrio - Strip IPG 7cm pH 3-10 - Gel de poliacrilamida 2-D PAGE - Fuente de electroforesis - Cubetas de electroforesis Mini-Protean - Equipo Protean® IEF cell y accesorios

Reactivos - Tampón de lisis - Tampón de rehidratación - Disolución de equilibrado - Reactivo de Bradford - Tampón PBS 1X - Albúmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL - Tampón de ánodo - Tampón de cátodo - Metanol - Ácido acético - Azul Coomassie - Patrón de peso molecular - Extracto de proteína de E.coli

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NOTA IMPORTANTE: Llevar siempre guantes cuando se manejen las tiras IPG, las soluciones o las partes del equipo en contacto con las tiras para evitar contaminaciones debido principalmente a la queratina de la piel.

3. Procedimiento 3.1. Primera Sesión. Extracción de proteína e isoelectroenfoque (IEF) •

Preparación de la muestra (día previo a la práctica)

Preparar un preinóculo de cultivo sembrando una colonia bacteriana en 5 mL de medio LB e incubar durante toda la noche con agitación a 37ºC. Al día siguiente coger los 5 ml del inóculo y diluirlos en 50 mL de LB. Incubar durante 3 horas a 37ºC para obtener un cultivo bacteriano en fase exponencial. Centrifugar el cultivo bacteriano a 1000xg (1500 rpm en la centrífuga de prácticas) durante 15 min y conservar el precipitado de bacterias para la realización de la práctica. Guardar uno de los precipitados después de escurrir todo el sobrenadante para liofilizar y realizar los cálculos posteriores relativos al rendimiento de proteína.

DÍA 1º

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Lisis bacteriana

Se procederá a realizar la lisis bacteriana mediante un tampón de lisis y varios ciclos de sonicación para provocar la ruptura de la pared bacteriana. Los grupos de prácticas se repartirán en dos bloques para llevar a cabo dos tipos de lisis bacteriana (consultar con el profesor).

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Protocolo de lisis: -

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Añadir 2 mL de tampón PBS 1X al precipitado de bacterias y centrifugar a 1000xg durante 10 min en una centrífuga de mesa. Eliminar el sobrenadante y añadir 2 mL de tampón de lisis A o B (*preguntar al profesor de prácticas sobre el tampón de lisis a utilizar). Sonicar en el baño de utrasonidos durante 10 min y después agitar vigorosamente la muestra en el vortex durante 5 min (realizar este ciclo al menos 2 veces). Centrifugar a 1000xg durante 10 min. Guardar el sobrenadante en frío y descartar el precipitado. Comprobar el volumen total de proteína para la determinación posterior de la concentración de proteína.

*Tipos de buffer de lisis: • •

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Tampón de lisis A: Tris 20 mM, pH 7.0 Tampón de lisis B: Urea 3M, CHAPS 0.5% (3-[(3colamidopropil) dimetilamonio]-1propanosulfonato), DTT 5 mM.

Rehidratación de las IPG strips mediante el método de rehidratación pasivo

Según el grupo de prácticas, se realizará el isoelectroenfoque con una de las tres muestras diferentes. Por una parte se procesarán dos tipos distintos de lisis (muestra A, tres grupos; y muestra B, tres grupos) de un cultivo bacteriano de E. coli CECT 515 y una tercera muestra procederá de un patrón de E. coli de fuente comercial (muestra C), cuatro grupos. Muestra A y B. Poner 50 µL del sobrenadante de proteínas de la lisis en un tubo eppendorf y llevarlo hasta un volumen final de 130 µL con tampón de rehidratación (Urea 8M, CHAPS 2%, 50 mM DTT, 0.4% de disolución de anfolitos [Bio-Lyte 3-10], trazas de bromofenol). El tampón de hidratación utilizado consiste en una disolución 1X. Las trazas de azul de bromofenol sirven para visualizar la muestra en el gel. Mezclar suavemente y centrifugar durante unos segundos para perder el mínimo volumen al tomar con la pipeta.

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Muestra C. En un tubo eppendorf poner 15 µL del patrón de proteínas de E. coli (1.59 µg/µL) y añadir 120 µL de tampón de rehidratación. Mezclar suavemente y centrifugar durante unos segundos para perder el mínimo volumen. Comentar con el profesor de prácticas cómo se va a realizar la distribución de las muestras en la cubeta de hidratación/equilibrado del equipo Protean IEF. Visualizar el tutorial de uso de las IPGs strips en: http://www.bio-rad.com/prd/es/ES/LSR/PDP/56994cbe-ea1b-48d8-b7e9bc17726c0d70/ReadyStrip-IPG-Strips

Tomar el total de cada una de las muestras con una micropipeta (P200) y distribuirlo cuidadosamente a lo largo de cada una de las calles de la cubeta de equilibrado, con cuidado de no invadir el resto de las calles. La muestra debe ocupar toda la calle de manera uniforme y sin formar burbujas pues éstas pueden interferir con la distribución de la muestra en el strip. Quitar cuidadosamente el plástico del IPG strip con la ayuda de unas pinzas. Posicionar la tira con la cara de acrilamida hacia abajo y depositarlo lentamente sobre la disolución de proteína evitando la formación de burbujas, tal y como se observa en la figura (preguntar al profesor de prácticas por el modo correcto de hacerlo). Observar la posición del polo “+” y el rango de pH marcados en la tira. Evitar que la disolución de proteína sobrepase el plástico de la tira pues esta porción no se absorberá en la acrilamida. Evitar la formación de burbujas debajo de la tira, si esto ocurriera, levantar la tira y depositarla de nuevo para eliminarlas. Almacenar a temperatura ambiente durante un mínimo de 1 hora para que la tira absorba completamente la proteína (en la práctica utilizaremos 1,5 hr). A veces se requieren hasta 12 h para una rehidratación completa de las tiras y la incorporación de la proteína a las mismas. En estos casos se utilizará aceite mineral para eliminar evaporaciones.

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Isoelectroenfoque (IEF)

Sacar la tira cuidadosamente de la cubeta de equilibrado y escurrir el aceite mineral apoyándola de forma vertical sobre un papel de filtro durante unos segundos. Lavar la cubeta cuidadosamente para reutilizarla después del IEF. Alternativamente situar la tira con el plástico hacia arriba para drenar el aceite sobre papel de filtro y poner otra lamina de papel de filtro suavemente para eliminar el exceso de proteína (opcional). Colocar sobre los electrodos de la cubeta de isoelectroenfoque unos filtros de celulosa precortados empapados en 10 µL de agua bidestilada para facilitar la transmisión de la corriente. Dichos filtros son importantes como receptáculo de sales y otros constituyentes no anfóteros, lo que permite una mejora en la calidad de los resultados y una conducción más eficaz de la corriente. Asegurarse de que la cubeta está perfectamente limpia. Situar la tira IPG en la cubeta de IEF con la acrilamida hacia abajo y sobre los filtros de manera que el polo positivo de la tira quede orientado hacia el ánodo (+) de la placa de electroforesis. Añadir 2 mL de aceite mineral sobre el IPG strip para evitar la evaporación de la muestra durante el transcurso del isoelectroenfoque. Añadir el aceite lentamente depositándolo sobre el plástico de la tira trasladando lentamente la pipeta.

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Protocolo de voltaje del equipo Protean® IEF cell

El isoelectroenfoque se realiza mediante una combinación de distintas rampas de voltaje. A continuación se citan los parámetros programados en el equipo para la realización del isoelectroenfoque y el programa de rampas de voltaje:

Condiciones -

Voltaje máximo: 4000 v Voltaje por horas: 10500v-h Límite de corriente: 50 µA por strip IPG para prevenir sobrecalentamiento. Temperatura de isoelectroenfoque: 20ºC

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Etapas 1. Etapa de acondicionamiento: 250 v durante 20 min (esta etapa inicial se utiliza para eliminar cargas contaminantes de sales e iones). 2. Rampa de voltaje: 1 h a 500 voltios con gradiente rápido 1 h a 2000 voltios con gradiente rápido 1 h a 4000 voltios con gradiente rápido 3. Etapa final del electroenfoque: 1 h a 4000 voltios con gradiente linear 4. Etapa de mantenimiento: se mantiene a 500 v hasta que se detiene el equipo para evitar la difusión de las proteínas.

Realizar el isoelectroenfoque durante 5-6 horas (el profesor de prácticas terminará el isoelectroenfoque). Después del isoelectroenfoque, si no se va a efectuar la segunda dimensión de forma inmediata, se sacan las tiras de la cubeta, se escurre el exceso de aceite mineral durante unos segundos y se almacenan las tiras en la cubeta de equilibrado (limpia, seca y cubierta por plástico transparente a -80 ºC) con la cara que contiene la acrilamida hacia arriba. Al día siguiente se procederá a realizar la etapa de equilibrado antes de llevar a cabo la segunda dimensión.

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DÍA 2º

3.2. Segunda dimensión. Gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) •

Preparación del gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) para electroforesis

Para realizar esta electroforesis no es necesario preparar un gel concentrador puesto que las proteínas se encuentran concentradas en una tira de reducido tamaño, por tanto, se procederá directamente a realizar un gel separador del 12% de acrilamida mediante el siguiente protocolo: -

Añadir los siguientes reactivos en un vaso de precipitado de 25 mL, dejando el persulfato amónico y el TEMED para el final (las cantidades de la siguiente tabla son para la preparación de un gel). Gel separador de 12% de acrilamida Agua (mL) 3.25 Tris 1,5 M (mL) pH 8.8 2.5 SDS 10% (µL) 100 Acrilamida (mL) 4.08 PSA (µL) Temed (µL)

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En esta fase de la práctica se utilizarán cubetas Mini-Protean Tetra cell, capaces de alojar hasta cuatro geles de poliacrilamida cada una (4 grupos). Consultar con el profesor de prácticas el modo de ensamblaje de los cristales en cada una de ellas (pag. 10). Preparar el sistema de cristales con sus espaciadores en el sistema MiniProtean Tetracell para proceder a la polimerización del gel entre los cristales. Una vez montados los cristales, añadir un poco de agua destilada para asegurarse de que el sistema no pierde. Mientras se agita suavemente, agregar 70 µL de PSA a la mezcla de preparación del gel y, a continuación, añadir 7 µL de TEMED. Mezclar y verter cuidadosamente entre los cristales con una pipeta hasta aproximadamente 0,5 cm desde el borde superior del cristal pequeño. Añadir lentamente agua destilada para cubrir todo el molde y obtener una superficie superior rectilínea.

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•

Dejar polimerizar durante al menos 20 min. Una vez polimerizado el gel, eliminar bien el agua destilada utilizando un poco de papel de filtro (eliminar el agua justo antes de introducir la tira de IEF).

Equilibrado de la tira IPG

En algunos casos, después de terminar el IEF, las tiras pueden ser teñidas con azul de Coomassie R-250 para comprobar si el isoelectroenfoque ha transcurrido de forma adecuada.

Sacar la tira IPG del congelador y atemperar durante unos 10 minutos en la cubeta de rehidratación/equilibrado (no sobrepasar este tiempo para evitar la difusión de las proteínas). Confirmar que la tira tiene la cara de acrilamida hacia arriba. Cuando están congeladas, las tiras son opacas debido a la precipitación de la urea en frío. Una vez atemperada la tira, se procede al equilibrado de la misma. Para ello, se añaden sobre la tira 2 mL de disolución de equilibrado I (Urea 6 M, Tris-HCl 0.375 mM pH 8.8, SDS 2%, Glicerol 20%, DTT 2% (p/v)). Esta disolución ha de ser preparada fresca previamente a su utilización. Agitar lentamente durante 15 min en un agitador orbital. Eliminar la disolución de la cubeta mediante decantación volcando lentamente sobre el extremo cuadrado de la cubeta para evitar que se salga la tira y eliminar las últimas gotas de disolución golpeando suavemente. Añadir la disolución de equilibrado II (Urea 6 M, Tris-HCl 0.375 mM pH 8.8, SDS 2%, Glicerol 20%, iodoacetamida 0.025 mg/mL) e incubar durante 15 min, eliminando la disolución al final de este paso de la misma manera que la anterior. •

Dimensión desnaturalizante (SDS-PAGE) −

Lavar durante unos seg la tira en una probeta lo suficientemente alta para cubrirla con tampón 1X Tris-Glicina-SDS, dejar la tira apoyando su cara de plástico sobre el cristal más grande de los dos (trasero) con la acrilamida hacia

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arriba. -

Calentar la agarosa de bajo punto de fusión (0.5%) en un microondas (45-60 seg). Dejar enfriar hasta que no queme al tacto.

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Verter la agarosa líquida lentamente entre los dos cristales con una pipeta pasteur hasta que rebose y no se vean irregularidades en el gel.

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Con unas pinzas fina o una espátula, empujar lentamente la tira IPG hacia abajo hasta que penetre entre los dos cristales y toque la acrilamida, con cuidado de no formar burbujas. Empujar sobre el plástico y no sobre la acrilamida de la tira.

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Impregnar un papel de filtro de celulosa precortado con 5µL del patrón de peso molecular e introducirlo en uno de los lados hasta tocar la tira (preferiblemente junto a la marca del polo (+) situada en la tira. Esta disolución lleva azul de bromofenol con el objetivo de visualizar el curso de la electroforesis. Dejar solidificar la agarosa durante 5-10 min. Si se observan burbujas, presionar con una espátula o punta para eliminarlas.

-

Montar los geles en la cubeta Mini-Protean y añadir los tampones de electroforesis (consultar con el profesor de prácticas el volumen de tampón a preparar de cada uno en función del nº de geles y el tipo de cubeta). Preparar tampón de cátodo a partir de un stock 10X suficiente para llenar el compartimento interno (Tris-HCl 12 mM pH 8.3, Glicina 186 mM, SDS 0.1%). Añadir el tampón de cátodo en el compartimento interno. Preparar el volumen necesario de tampón de ánodo y añadirlo en el compartimento externo (Tris-HCl 366 mM, pH 8,8). Consultar con el profesor qué grupos preparan cada uno de los tampones. Posición

Composición

Tetracell 4 geles

Tetracell 2 geles

Buffer cátodo (-)

Interior

Diluir 10X → 1X

2x100 mL

100 mL

Buffer ánodo (+)

Exterior

(366 mM, pH 8,8) MW : 121,14

1L

0,5 L

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Conectar a la fuente y programar la electroforesis a un voltaje constante de 200 v durante 40 min.

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Después de acabar la electroforesis, desconectar la fuente de alimentación, separar los cristales con cuidado, sacar el gel y ponerlo en un recipiente de lavado. Fijarse en la marca + de la Strip que corresponde que el valor de pH más

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bajo y marcar adecuadamente el gel en esa posición. -

Lavar con abundante agua bidestilada y dejar toda la noche sumergido en 100 mL de metanol al 50% y ácido acético al 10% (disolución de fijación).

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CUBETA Mini-Protean Tetra Cell

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DÍA 3º

3.3. Tinción del gel bidimensional. Determinación de la concentración de proteína mediante ensayo Bradford.

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Revelado del gel mediante tinción con azul de Coomassie

Existen diversos protocolos de tinción de geles bidimensionales con diferente sensibilidad. En el presente protocolo utilizaremos Azul de Coomassie brillante R-250. Proceder a la tinción y desteñido de los geles utilizando el protocolo siguiente: A. Lavado Lavar el gel con abundante agua destilada durante 15 min. Realizar un par de cambios de agua durante este periodo. Preparar suficiente disolución de tinción para el paso siguiente con el objetivo de que se cubra abundantemente el gel. B. Tinción Sumergir el gel durante 30 min en la disolución de tinción. La disolución de tinción está compuesta por: - Azul de Coomassie: 1g/L - Metanol: 40% - Ácido acético: 20% C. Lavado Realizar un breve lavado con agua destilada (2-3 min). Preparar la disolución de revelado/ desteñido. D. Revelado Sumergir el gel en la disolución de revelado durante un mínimo 2 horas, realizando al menos un par de cambios (añadir algodón para acelerar el proceso de desteñido): - Metanol: 20% - Ácido acético glacial: 20% - Glicerol: 1%

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Cuantificación de la proteína extraída del cultivo de E. coli mediante ensayo Bradford -

El ensayo Bradford se basa en la interacción química entre el azul de Coomassie G-250 y aminoácidos básicos (Arg) y aromáticos de la proteína. La unión del colorante a la proteína desplaza el máximo de su espectro de 465 nm (rojo) a azul (595 nm), longitud de onda a la que se mide finalmente el complejo. Estos cambios del color se deben a la variación de la carga neta de la molécula debido a la relación entre los grupos amino (+) y sulfonato (-) entre las formas libre y la asociada a la proteína debido a las diferencias de pH en los entornos en los que se encuentra el colorante.

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Preparar una serie de 11 tubos eppendorf y completarlos según la tabla adjunta, siete tubos para la recta patrón y cuatro tubos para la muestra. El patrón utilizado es BSA (albúmina de suero bovino) y está preparado a una concentración de 0,1 mg/mL.

1

Patrón / Muestra (µL) 0

2

10

790

3

25

775

4

50

750

5

100

700

6

150

650

7

200

600

8

10

790

9

10

790

10

20

800

11

20

800

PATRÓN

Tubo

MUESTRA

•

PBS (µL)

ABS

800

-

Añadir 200 µL de reactivo comercial de Bradford y esperar 15 min.

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Medir la absorbancia a 595 nm de todos los tubos en una cubeta de plástico.

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4. Preguntas 1) Obtener la recta patrón con los valores obtenidos del estándar de proteína. Hacer la media de los cuatro valores de la muestra y determinar la concentración de la proteína en el sobrenadante de la lisis a partir de la recta de calibrado. Determinar el porcentaje de proteína en las bacterias frente al peso seco total (preguntar al profesor el peso después de liofilizar). 2) Explicar brevemente las diferencias entre la electroforesis bidimensional (2DE) y la electroforesis bidimensional diferencial (2DIGE). 3) ¿Sobre qué rangos de pH aproximados se sitúan los spots más intensos observados?, ¿entre qué pesos moleculares oscilan aproximadamente las proteínas más intensas que se observan? 4) ¿Con qué tipo de lisis se obtiene una mayor cantidad de proteínas en el gel bidimensional? ¿Cuál puede ser la causa? 5) Explicar el fundamento molecular de la tinción con azul de Coomassie. 6) ¿Cuál es la finalidad del proceso de reequilibrado después del IEF? 7) Visitar el servidor sobre bases de datos de 2DE para comprobar las numerosas bases de datos libres existentes http://world-2dpage.expasy.org/list/ 8) Entrar en la base de datos SWISS- 2DPAGE (http://world2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/ ). Entrar en Maps / Graphical interface y elegir el primer gel 2D de E. coli. Identificar la proteína más abundante en el gel bidimensional (Access protein entry, punto isoeléctrico y peso molecular). Elegir Protein list en el menú de la izquierda y elegir de nuevo el gel bidimensional de E. coli hasta que aparezca la lista completa de proteínas identificadas. Buscar la proteína anterior y describir su función. Si es posible, intentar encontrar similitudes entre el gel que se ha obtenido en la práctica y el gel que aparece en la base de datos. 9) Visualizar los ejemplos sobre posibles problemas en geles bidimensionales http://www.biorad.com/evportal/destination/solutions?catID=LUSQRG30E#gel8 - ¿Cómo se manifiesta normalmente una sobrecarga de proteína? - ¿Qué se observa en el gel cuando una zona de la tira no queda en contacto con la disolución de rehidratación?. - ¿Qué efectos produce un tiempo de isoelectroenfoque insuficiente? 10) Escanear el gel realizado en prácticas e intentar explicar el resultado obtenido en función de la forma y distribución de los spots obtenidos. Indicar de forma aproximada el peso molecular y el pI de la proteína más abundante.

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